[发明专利]一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法

权利要求书

1.一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，其特征在于，将多种氨基修饰的DNA序列分别组装到微孔板上，将微孔封闭；随后将与微孔中氨基修饰的DNA序列相匹配的生物素修饰的miRNA溶液和待测靶点miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并发生竞争杂交反应；最后将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB的显色反应，从而对靶点miRNA序列定量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所检测的三种存在于胶质瘤血清中的miRNA序列为：

miR-182：5'-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3'；

miR-185：5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3'；

miR-381：5'-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3'。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，

miR-182对应的氨基修饰的DNA序列为

3'-AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH₂)₆NH₂-5'；

miR-185对应的氨基修饰的DNA序列为

3'-ACC TCT CTT TCC GTC AAGGACT TTT TT-(CH₂)₆NH₂-5'

miR-381对应的氨基修饰的DNA序列为

3'-ATA TGT TCC CGT TCG AGA GACA TTT TT-(CH₂)₆NH₂-5'。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，微孔中分别滴加60μL的1nM的氨基修饰的DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液冲洗。

5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，氨基修饰的DNA组装后在每个微孔中分别滴加180μL质量浓度为2%的BSA溶液，室温下静置2.5h后，用PBS缓冲液冲洗。

6.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，生物素修饰的miRNA和待测靶点miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修饰的miRNA182浓度为0.5nM，生物素修饰的miRNA381和miRNA185浓度均为1nM。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的竞争杂交反应在37℃下反应2.5-3h。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

竞争杂交反应完成后在每个微孔中分别滴加SA-Poly-HRP溶液，室温下静置1h后，采用PBS缓冲液冲洗。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H₂O₂溶液先后加入到衍生后的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止显色反应；最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值。