[发明专利]一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，属于miRNA序列检测技术领域。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一组短的、不编码蛋白质的内源性小RNA分子，其长度约为17～25个核苷酸(nt)。miRNA在生物体内的产生是一个复杂的过程。首先，pri-miRNA(初级miRNA)在细胞核内在Drosha酶的作用下形成具有发夹结构的pre-miRNA(前体miRNA)；然后，pre-miRNA被转运到细胞质后在Dicer酶的作用下转变成含有17～25个核苷酸的成熟miRNA。现在已有1000多种miRNA序列被检测出，但大部分miRNA存在相似的序列以及功能。

目前，miRNA的检测主要是基于杂交和扩增的方法。定性和定量的检测技术主要有：Northern blotting印迹法、聚合酶链式反应(PCR)、微阵列芯片(microarray)、滚环扩增等，这些方法都是通过碱基互补配对原理进行杂交，然后结合分离、标记以及荧光、电化学等方法对miRNA进行分析检测。其中，Northern blotting印迹法是一种半定量的检测方法，步骤繁琐且耗时、灵敏度不高。PCR技术能够对miRNA进行高灵敏、高特异性的定量检测，但该方法步骤繁琐，需要对miRNA进行预处理。Microarray法虽然在短时间内能快速、高通量地检测大量miRNA序列，但其成本高，无法区分碱基相差很小的同族miRNA序列。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于同时检测多种miRNA序列的方法，该方法简单、快速、灵敏度高、选择性好，且无需对实际样品标记。

一种基于竞争杂交反应同时检测多种miRNA序列的比色方法，将多种氨基修饰的DNA序列分别组装到微孔板上，将微孔封闭；随后将与微孔中氨基修饰的DNA序列相匹配的生物素修饰的miRNA溶液和待测靶点miRNA序列溶液混合滴加在孔板表面并发生竞争杂交反应；最后将亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶衍生到微孔表面，多聚辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB的显色反应，从而对靶点miRNA序列定量。

所检测的三种存在于胶质瘤血清中的miRNA序列为：

miR-182：5'-UUU GGC AAU GGU AGA ACU CAC ACU-3'；

miR-185：5'-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUGA-3'；

miR-381：5'-UAU ACA AGG GCA AGC UCU CUGU-3'。

miR-182对应的氨基修饰的DNA序列为

3'-AAA CCG TTA CCA TCT TGA GTG TGA TTT TT-(CH₂)₆NH₂-5'；

miR-185对应的氨基修饰的DNA序列为

3'-ACC TCT CTT TCC GTC AAGGACT TTT TT-(CH₂)₆NH₂-5'

miR-381对应的氨基修饰的DNA序列为

3'-ATA TGT TCC CGT TCG AGA GACA TTT TT-(CH₂)₆NH₂-5'。

上述方法中微孔中分别滴加60μL的1nM的氨基修饰的DNA溶液，静置过夜，用PBS缓冲液冲洗。氨基修饰的DNA组装后在每个微孔中分别滴加180μL质量浓度为2%的BSA溶液，室温下静置2.5h后，用PBS缓冲液冲洗。生物素修饰的miRNA和待测靶点miRNA序列配制成的混合溶液中生物素修饰的miRNA182浓度为0.5nM，生物素修饰的miRNA381和miRNA185浓度均为1nM。所述的竞争杂交反应在37℃下反应2.5-3h。竞争杂交反应完成后在每个微孔中分别滴加SA-Poly-HRP溶液（每孔滴加60μL，SA-Poly-HRP购自RB-Sigma，货号S2438-250UG，采用PBS缓冲液按体积比为1:500进行稀释得到），室温下静置1h后，采用PBS缓冲液冲洗。将100μL0.1%TMB溶液和25μL0.03%的H₂O₂溶液先后加入到衍生后的微孔中，室温下反应10min后，再加入120μL2mol/L HCl溶液终止显色反应；最后将酶标板放入酶标仪中，在450nm下检测吸光度值。