[发明专利]鉴定虫草的环介导等温扩增方法和试剂盒

说明书

技术领域

本申请涉及虫草的鉴定方法和试剂盒及其应用，尤其涉及冬虫夏草的鉴定方法与试剂盒及其应用。

背景技术

冬虫夏草（Cordyceps sinensis），又名中华虫草，是中国传统的名贵中药材，是由肉座菌目、麦角菌科、虫草属的冬虫夏草菌，寄生于高山草甸土中的蝠蛾幼虫，使幼虫身躯僵化直至其死亡。经过一个冬天，到第二年春天来临，霉菌菌丝开始生长，到夏天时长出地面，由僵虫头端抽生出长棒状的子座而形成，即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核（幼虫尸体）构成的复合体。冬虫夏草主要产于中国青海、西藏、四川、云南、甘肃和贵州等省及自治区的高寒地带和雪山草原。

真正的冬虫夏草均为野生，生长在海拔3000米至5000米的高山草地灌木带上面的雪线附近的草坡上。由于冬虫夏草具有极高的药用和营养价值，而真正野生的冬虫夏草产量小，供不应求，其商业价值不断增长。为确保真正的冬虫夏草药用品质和商业价值，对真正的冬虫夏草的鉴定是非常重要的。

冬虫夏草通常含有虫草酸约7%，碳水化合物约28.9%，脂肪约8.4%，蛋白质约25%，脂肪中82.2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、生物碱等。目前还没有发现冬虫夏草中含有特异的化合物能够作为特异化学标志物来对其进行鉴定，因此至今未发现可以采用化学的方法来鉴定冬虫夏草。基于多聚酶链式反应(PCR)开发的鉴定方法因需要热循环仪和电泳仪等设备而使得鉴定成本提高，同时实验过程费时耗力，也有待进一步改进。

发明内容

第一方面，本申请提供一种鉴定虫草的环介导等温扩增（LAMP）方法，包括，

提取欲鉴定虫草样品的DNA，作为DNA模板，

提供用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis或C.sinensis）的特异序列而设计的，

将所述引物与DNA模板与接触，在链置换DNA聚合酶的存在下，恒温扩增，

确定所述扩增产物或副产物的存在，例如通过肉眼或荧光或紫外光照射观察所述产物或副产物，或通过核酸染料溴化乙錠、SYBR Green、EvaGreen、GelRed等在自然光线下和(或)紫外光线下观察所述扩增产物。如果存在所述的产物或副产物，所鉴定的虫草样品即为冬虫夏草。

在一些实施方案中，如果所述方法得到的产物或副产物不存在，所述方法则进一步包括将所述DNA模板与针对假冬虫夏草的特异序列的引物接触，从而鉴定所述虫草样品为假冬虫夏草，在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii或C.gunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris或C.militaris）。

第二方面，提供一种利用环介导等温扩增方法鉴定虫草的试剂盒，其包含用于环介导等温扩增中的引物，其中所述引物是针对冬虫夏草（Cordyceps sinensis或）的特异序列而设计的。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括针对假冬虫夏草的特异序列的引物。在一些实施方案中，所述假冬虫夏草例如是古尼虫草（Cordyceps gunnii）或蛹虫草（Cordyceps militaris）。在一些实施方案中，所述试剂盒用于实施第一方面所述的方法。

附图说明

图1显示了利用内部控制引物对冬虫夏草（C.sinensis）、古尼虫草（C.gunnii）和蛹虫草（C.militaris）DNA样品进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。

图2显示了利用针对冬虫夏草特异序列所设计的引物对冬虫夏草样品(T2973,T2975和T2996)、古尼虫草样品(T2983和T2984)和蛹虫草样品(T3004)DNA进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。

图3显示了利用针对古尼虫草特异序列所设计的引物对古尼虫草样品(T2983和T2984)、冬虫夏草样品(T2973,T2975和T2996)和蛹虫草样品(T3004)DNA进行环介导等温扩增分析得到的荧光检测结果，图中的曲线显示了初始反应和反应达到饱和（曲线进入平台期）情况。