[发明专利]一种表达嗜热内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法

权利要求书

1.一种表达嗜热内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以携带有嗜热葡聚糖酶基因的质粒pET21a(Amp+)- ph1171-sgc-mut-sd为模板，进行PCR扩增，引物：

5’1171SD-XhoI-F   

5’-CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3’

3’1171SD-NotI-R   

5’-TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3’

在嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入Xho I和Not I两个酶切位点，使用Tli DNA聚合酶扩增得到大小为1168 bp的嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因；

2）将上述通过PCR扩增得到的嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因及质粒pPICZα-A经Xho I和Not I双酶切回收后，再经T4 DNA连接酶连接，插入到pPICZα-A的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5α，在Zeocin^TM LB平板上筛选阳性转化子并测序；

3）将测序正确的阳性克隆培养，大量提取质粒后，采用Sac I线性化并使用乙醇沉淀线性化产物，用于毕赤酵母转导；

4）重组表达载体pPICZα-A-ph1171-sgc-mut-sd经Sac I完全酶切线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母 X33并涂布Zeocin^TM YPDS平板，30 ℃孵育平板3至7天，对转化子进行Mut表型鉴定，得到Mut⁺菌株；

5）将Mut⁺表型的转化子点种到Zeocin^TM （2000 μg/ml）YPDS平板，30℃孵育2天，筛选得到抗高浓度Zeocin^TM水平的重组酵母多拷贝重组子；

6）将上述抗高浓度Zeocin^TM水平的重组酵母多拷贝重组子接种于25 ml BMGY培养基（250 ml摇瓶）中，在30℃、250 rpm下培养至OD₆₀₀=3，然后在室温、1500-3000 g条件下，离心5分钟，收集细胞，去除上清，用BMMY培养基重悬细胞至OD₆₀₀=1；

7）利用甲醇诱导表达72小时；其间每24小时补加甲醇至终浓度为0.5%，每12小时取样1 ml，在室温、最大转速离心条件下，离心2分钟，将上清转移至单独管中，利用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析重组蛋白的表达。