[发明专利]一种表达嗜热内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法

说明书

技术领域

  一种表达嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

酶作为大分子的活性物质，以其独有的催化特性，已被广泛应用于化工、食品、环境等领域。但由于目前市场上应用的酶多为常温酶，在高温、强碱、强酸、高盐等条件下容易变性失活，这在很大程度上限制了酶制剂的推广及应用。目前，极端微生物以丰富的代谢类型和生活环境的多样性，已经引起了科学界和企业界的极大兴趣，从极端微生物中挖掘及开发新的酶源成为近十几年工业生物技术领域研究的热点之一。

目前在纺织应用领域（例如织物处理、洗涤、柔化、人造丝加工）中，国内多使用传统的混合型纤维素酶制剂，其会对纤维主体结构造成不必要的损伤，较优选择是使用只有内切纤维素酶活性的单一组分纤维素酶。而目前应用的单一组分纤维素酶多为中性纤维素酶，需要大量进口，且由于为常温酶，在应用时需要先降温再进行后续处理，带来了工艺上的繁杂性和不便性。同时在纺织整理环境中不可避免地存在金属离子、离子性染料及表面活性剂等将会对常温酶的催化效率和稳定性产生影响，势必延长了作业周期，增加了使用酶制剂工艺的生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶的重组毕赤酵母的构建方法。通过上述方法构建的重组毕赤酵母菌株能够表达在高温下具较强酶解活力的嗜热内切-β-1,4-葡聚糖酶。此类酶具有明显的水解结晶纤维素的能力且对不良环境具有较强的耐受性。此类新型酶制剂成功开发将不仅有利于提升国内酶制剂企业的新型酶产品开发的实力，还有助于纺织工业中尤其生物抛光（尤其棉制品）领域方面的技术改造及产业升级，减少环境污染及降低能量消耗，提升整体的国内技术实力。

本发明的技术方案为：

1.    以携带有嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的质粒pET21a(Amp+)- ph1171-sgc-mut-sd为模板，进行PCR扩增，引物：

5’1171SD-XhoI-F   

5’-CACTACCTCGAGAAAAGAATGGAAAATACAACATATCAA-3’

3’1171SD-NotI-R   

5’-TGGGATGCATGCGGCCGCTCAAGAACTTTTGGAACAA-3’

在嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因两端分别引入Xho I和Not I两个酶切位点，使用Tli DNA聚合酶扩增得到大小为1168 bp的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因。

2.    将上述通过PCR扩增得到的嗜热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因及质粒pPICZα-A经Xho I和Not I双酶切回收后，再经T4 DNA连接酶连接，插入到pPICZα-A的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5α，在Zeocin^TM LB平板上筛选阳性转化子并测序。

3.    将测序正确的阳性克隆培养，大量提取质粒后，采用Sac I线性化并使用乙醇沉淀线性化产物，用于毕赤酵母转导。

4.    重组表达载体pPICZα-A-ph1171-sgc-mut-sd经Sac I完全酶切线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母 X33并涂布Zeocin^TM YPDS平板，30 ℃孵育平板3至7天，对转化子进行Mut表型鉴定，得到Mut⁺菌株。

5.    将Mut⁺表型的转化子点种到Zeocin^TM （2000 μg/ml）YPDS平板，30℃孵育2天，筛选得到抗高浓度Zeocin^TM水平的重组酵母多拷贝重组子。

6.    将上述抗高浓度Zeocin^TM水平的重组酵母多拷贝重组子接种于25 ml BMGY培养基（250 ml摇瓶）中，在30℃、250 rpm下培养至OD₆₀₀=3，然后在室温、1500-3000 g条件下，离心5分钟，收集细胞，去除上清，用BMMY培养基重悬细胞至OD₆₀₀=1。

7.    利用甲醇诱导表达72小时；其间每24小时补加甲醇至终浓度为0.5%，每12小时取样1 ml，在室温、最大转速离心条件下，离心2分钟，将上清转移至单独管中，利用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析重组蛋白的表达。

 

附图说明