[发明专利]短蛸丝氨酸蛋白酶抑制剂OoSerpin基因及其重组蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是从短蛸cDNA文库中获得短蛸Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂OoSerpin基因的全长cDNA序列，对其基因编码区进行体外重组表达；涉及到该重组蛋白的分离纯化及其对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用，以及对大肠杆菌生长的抑制作用；还涉及该重组蛋白作为蛋白酶抑制剂在人类疾病治疗和作为抑菌剂添加在动物饲料中的潜在应用。

背景技术

先天性免疫防御是无脊椎动物抵抗病原感染的第一道防线，当病原微生物入侵机体后，宿主主要是通过以下几种方式完成免疫防御：首先是，通过先天性免疫系统的模式识别受体对外来异物的识别；随后，非己识别信号引发激活丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反应，从而将受到感染的信号放大为更强的“危险”信号或解除错误警报；然后激活相应的信号转导途径，引发目的基因的转录活性；最后，激活效应物反应系统来杀死和清除病原体。丝氨酸蛋白酶抑制剂作为一种重要的免疫因子，通过抑制过多的蛋白酶的有害水解激活来调节免疫反应，在无脊椎动物的免疫应答中具有重要的作用。目前已发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂有数百种，它们被划分为十几个家族，动物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂主要分布在Serpin、Kazal、Kunitz和α-巨球蛋白四个家族。其中，Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有相对较大的分子量(40-60kDa)和相对保守的空间结构，并在C端具有活性中心环(Reactive centre loop, RCL)。Serpin的RCL可以插入到特定靶酶的活性位点，从而形成一个稳定的复杂体或产生构象的改变，以防止生物体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活，以调节体内蛋白酶级联反应。Serpin特定的空间结构可以有效地抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，在抵御病原体和抑制细菌生长过程中发挥重要作用。近年来，虽然已经在海洋动物中发现多种丝氨酸蛋白酶抑制剂，但是迄今为止对于海洋无脊椎动物Serpin型蛋白酶抑制剂及其功能的研究十分有限，未见关于短蛸Serpin型蛋白酶抑制剂的报道。

发明内容

本发明提供10个短蛸的微卫星位点，以及相应的多态性微卫星引物，为克隆短蛸Serpin型蛋白酶抑制剂基因，对其结构域进行蛋白重组，分析重组蛋白的活性，为深入了解无脊椎动物先天性免疫，开发天然的海洋药物和饲料添加剂奠定基础。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：克隆得到了一种短蛸Serpin型蛋白酶抑制剂基因，该基因具有SEQ ID No. 1中的核苷酸序列，该序列全长1735bp，5’非编码区214bp，3’非编码区282bp，有多聚腺苷酸尾巴，开放阅读框1239bp，编码412个氨基酸；氨基酸序列如SEQ ID No. 2中所示，其中第1-25个氨基酸为信号肽序列；具有1个Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域，该结构域含有11个α螺旋结构和14个β折叠结构，编码蛋白分子量为46.5kDa，等电点为8.52。该重组蛋白与胰蛋白酶和糜蛋白酶分别以质量比18:1比例混合时，能分别抑制86.5% 和 55.0%的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性；在大肠杆菌生长抑制实验至第7.5小时，抑制大肠杆菌生长百分比为40.6%。

本发明填补有关短蛸Serpin型蛋白酶抑制剂研究的空白，提供一种利用该短蛸丝氨酸蛋白酶抑制剂Ooserpin基因生产重组蛋白的方法：所述的方法是从构建的短蛸转录组文库中，利用现代分子生物学技术分析得到了Serpin型蛋白酶抑制剂序列的cDNA全长，以原核表达的方法构建其重组质粒，诱导后纯化得到重组蛋白，重组蛋白经过复性，检测其对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用，及对大肠杆菌生长的抑制作用。 

前述的基因或蛋白或生产重组蛋白的方法可应用在制备胰蛋白酶抑制剂药物中。

前述的基因或蛋白或生产重组蛋白的方法可应用在制备糜蛋白酶抑制剂药物中。

前述的基因或蛋白或生产重组蛋白的方法制得的产品作为抑菌剂应用在食品添加剂中。

前述的基因或蛋白或生产重组蛋白的方法制得的产品作为抑菌剂应用在动物饲料添加剂中。

本发明的优点：克隆得到了一种短蛸Serpin型蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列，该基因具有SEQ ID No.1中的碱基序列，重组至载体中并表达出重组蛋白，得到的蛋白具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列。该重组蛋白能抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，并对大肠杆菌生长具有一定的抑制作用。该基因及其重组蛋白活性的研究，对于进一步了解Serpin型蛋白酶抑制剂基因在短蛸先天性免疫中发挥的作用，以及对研制新的人类疾病防治药物和动物饲料添加剂都具有重要的意义。