[发明专利]一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用

说明书

相关申请案的交叉参考

本申请案要求2012年10月30日申请的，申请号为201210424842.0，发明名称为“一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用”的中国专利申请案的优先权，其说明书是以引用的方式全部并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种细菌菌影的制备方法，由该方法制备得到的菌影及其应用。特别涉及一种干酪乳杆菌菌影的制备方法及由该方法制备得到的细菌菌影。属于生物技术领域。

背景技术

细菌菌影是将细菌细胞壁裂解、去除细胞内容物之后形成的细菌空壳。它具有完整的细菌表面抗原结构，能直接作为疫苗使用。同时，菌影还是一种良好的载体，其残留的内膜结构在重新封闭之后能够用于装载生物大分子。以往的菌影制备均利用Φx174噬菌体表达的一种裂解革兰氏阴性菌细胞壁的蛋白—E蛋白。将E蛋白的基因构建到可诱导的表达载体中，转化革兰氏阴性细菌，在合适的条件下诱导E蛋白表达，可使宿主菌的内膜和外膜融合，形成裂解通道，使细胞内容物由通道流出，再离心洗去细胞内容物后即可得到菌影。用这种方法，目前已经成功地制备了幽门螺旋菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌等细菌的菌影。

到目前为止，已报道的菌影均采用致病菌制备，而由于菌影制备技术还不能保证菌体100%完全裂解。因此，致病菌制备的菌影作为载体应用时，存在散播病原和感染的危险，因此在实践中不能推广应用。

发明内容

针对目前致病菌研制菌影的不足，本发明的目的在于提供一种安全、有效的能够作为载体使用的细菌菌影，并提供制备所述的菌影的方法。

为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

本发明选择干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）作为对象进行探索性研究。通过分离干酪乳杆菌的噬菌体，预测并克隆其裂解基因，同时利用干酪乳杆菌作为宿主菌，诱导裂解基因表达后制成菌影。

分离得到的干酪乳杆菌噬菌体属于双链DNA噬菌体，其编码的裂解相关酶类涉及到两个蛋白，即穿孔素(holin)和裂解素(lysin)，该两个蛋白共同组成了“两组分裂解盒”。穿孔素为一种小的疏水性膜蛋白，穿孔素单体迅速组装成多聚体，并在膜上形成非特异性的孔洞。通过孔洞，裂解素得以穿过膜到达周质空间降解肽聚糖而裂解细胞。

根据NCBI已公布的L.caseiATCC393噬菌体全基因组序列中编码裂解基因的ORF序列设计引物，提取噬菌体基因组DNA，并以其为模版，扩增裂解功能基因，分别克隆了编码穿孔素(holin)、裂解素(lysin)以及“两组分裂解盒”的基因，并将其分别与分泌表达的载体质粒pPG612进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌L.caseiATCC393细胞内，在木糖诱导下进行表达，摸索优化表达条件，提高菌影裂解率，选择最佳的诱导条件进行诱导，将培养物处理后，制成菌影悬液。通过对制备菌影的基本特性进行鉴定，发现通过表达裂解素(lysin)以及“两组分裂解盒”而制备得到的菌影，其裂解程度无法达到令人满意的程度，例如表达“两组分裂解盒”而制备得到的菌影其裂解程度较高，制备的菌影较难保持完整的形态。而通过表达穿孔素(holin)制备得到菌影，在诱导88h时，其裂解率为97.12%，并且能够保持完整的细菌形态。

在进行了以上研究的基础上，本发明人提出了本发明。

本发明为一种干酪乳杆菌菌影的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将噬菌体穿孔素基因克隆到干酪乳杆菌表达载体中，得到用于转化干酪乳杆菌的重组表达载体；

（2）将步骤（1）得到的重组表达载体电转化干酪乳杆菌，得到重组干酪乳杆菌；

（3）对步骤（2）得到的重组干酪乳杆菌进行培养，诱导噬菌体穿孔素蛋白的表达，获得所述的干酪乳杆菌菌影。

在本发明中，优选的，所述的干酪乳杆菌表达载体为乳酸菌表达载体pPG612.1。

在本发明中，优选的，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌L.casei 393。

其中，所述的干酪乳杆菌L.casei 393（Lactobacillus casei ATCC 393）已记载于产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析，李晓静，东北农业大学，2009年一文中，公众可通过商业途径购买得到。

在本发明中，优选的，所述的表达噬菌体穿孔素蛋白的基因的序列如SEQ ID NO.1所示。