[发明专利]伪狂犬病毒疫苗的生产方法

权利要求书

1.一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制苗用细胞的传代与培养：取细胞培养瓶中生长良好的传代细胞系细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37℃，形成细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；

（2）制苗用毒种的繁殖：将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种细胞单层，培养48～72小时，当细胞病变达75%以上时，收获感染细胞毒液，即为生产用毒种；

（3）传代细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤（1）中已形成的细胞单层，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，按5×10⁵/mL～5×10⁶/mL的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加入微载体，设定培养条件为：温度37℃、pH6.8～7.6、溶氧30%～60%和搅拌速度30～60转/分钟；

（4）制苗毒液的繁殖：当细胞达到5×10⁶/mL～5×10⁷/mL后进行接毒操作，所接入毒种为步骤（2）中生产的毒种，接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培养液将长满细胞的微载体洗涤2～4次，设定培养条件为：温度37℃、pH6.8～7.6、溶氧30%～60%和搅拌速度30～60转/分钟；

（5）伪狂犬病毒疫苗的收获：待微载体上细胞全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20℃条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗。

2.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，步骤（1）中所述的传代细胞系为BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系、Marc-145细胞系、Vero细胞系或ST细胞系。

3.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的生物反应器，所述生物反应器的容积为3L～3000L。

4.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述微载体为以交联葡聚糖为基质，用带有正电荷的N,N-二乙氨乙基基团进行取代的Cytodex系列微载体。

5.根据权利要求4所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述微载体在使用前需清洗、灭菌，具体方法为：用PBS浸泡微载体过夜，然后用PBS清洗微载体3遍，再用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌30分钟，微载体经清洗、灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，用高糖型DMEM清洗。

6.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述EDTA-胰酶细胞分散液是由质量体积分数为0.25%的规格为1：250的胰酶、质量体积分数为0.02%的EDTA的Hank's液组成，所述规格1：250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。

7.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述细胞生长液由重量分数90%～98%的DMEM液、重量分数2%～10%的牛血清及100～500单位/ml的抗菌素组成，所述细胞生长液pH为6.8～7.6。

8.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中的病毒培养液为含有胰酶的DMEM液，且DMEM液中含有100～500单位/ml的抗菌素，所述病毒培养液pH为6.8～7.6。

9.根据权利要求7或8所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。

10.根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法，其特征在于，所述步骤（4）中的毒种接种量为0.01～0.5MOI。