[发明专利]伪狂犬病毒疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明实施例涉及一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，具体涉及一种利用生物反应器微载体细胞悬浮培养生产伪狂犬病毒疫苗的方法。

背景技术

目前，国内伪狂犬病毒的疫苗生产唯一依靠转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；转瓶培养不同批次间的差异大；所需空间多；转瓶培养操作时被细菌或其它病毒污染可能性增大，因而致生产的疫苗或有质量隐患；转瓶培养时一旦发生污染，由于转瓶数量多，因而无害化处理难度大，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前已经有利用生物反应器微载体培养狂犬病疫苗的报道，但尚没有利用生物反应器微载体生产伪狂犬病毒的报道。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种生产成本低、生产周期短的应用生物反应器微载体细胞培养生产伪狂犬病毒疫苗的方法。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤：

（1）制苗用细胞的传代与培养：取细胞培养瓶中生长良好的传代细胞系细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为37℃，形成致密细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；

（2）制苗用毒种的繁殖：将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍，接种细胞单层，培养48～72小时，当细胞病变达75%以上时，收获感染细胞毒液，即为生产用毒种；

（3）传代细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤（1）中已形成的细胞单层，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，按5×10⁵/mL～5×10⁶/mL的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加入微载体，设定培养条件为：温度37℃、pH6.8～7.6、溶氧30%～60%和搅拌速度30～60转/分钟；

（4）制苗毒液的繁殖：当细胞达到5×10⁶/mL～5×10⁷/mL后进行接毒操作，所接入毒种为步骤（2）中生产的毒种，接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培养液将长满细胞的微载体洗涤2～4次，设定培养条件为：温度37℃、pH6.8～7.6、溶氧30%～60%和搅拌速度30～60转/分钟；

（5）伪狂犬病毒疫苗的收获：待微载体上细胞全部脱落，且溶解氧值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置与-20℃条件下反复冻融2次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得伪狂犬病毒疫苗。

在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，步骤（1）中所述的传代细胞系为BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系、Marc-145细胞系、Vero细胞系或ST细胞系。

在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的生物反应器，所述生物反应器的容积为3L～3000L。

在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述微载体为以交联葡聚糖为基质，用带有正电荷的N,N-二乙氨乙基基团进行一定程度取代的Cytodex系列微载体。

在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述微载体在使用前需清洗、灭菌，具体方法为：用PBS浸泡微载体过夜，然后用PBS清洗微载体3遍，再用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌30分钟，微载体经清洗、灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，用高糖型DMEM清洗，PBS为磷酸盐缓冲液，pH=7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾；DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。

在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述EDTA-胰酶细胞分散液是由质量体积分数为0.25%的规格为1：250的胰酶、质量体积分数为0.02%的EDTA的Hank's液组成，所述规格1：250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶，Hank's液是一种平衡盐溶液。

在上述伪狂犬病毒疫苗的生产方法中，优选的是，所述细胞生长液由重量分数90%～98%的DMEM液、重量分数2%～10%的牛血清及100～500单位/ml的抗菌素组成，所述细胞生长液pH为6.8～7.6。