[发明专利]猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法

权利要求书

1.一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：生产用细胞的传代与培养：取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好单层PK15或ST细胞；

步骤二：生产用种毒的繁殖：在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒接种到步骤一的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤一中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37℃、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱中吸附1h，然后加入细胞维持液，置于37℃、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75%～80%细胞出现病变时，收获病毒置于-15℃冰箱中，反复冻融细胞三次，此病毒液作为生产用种毒；

步骤三：PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤一中已形成良好单层PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵个细胞/ml～5×10⁶个细胞/ml的密度接种于生物反应器中进行培养；

步骤四：制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5×10⁶个细胞/ml～5×10⁷个细胞/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤二中的生产用种毒，接毒前用含有10μg/ml胰酶的病毒培养液洗涤生产用种毒2-4次；

步骤五：病毒液的收获：待微载体上细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置于-20℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。

2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。

3.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述微载体为Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3中的一种。

4.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述微载体在使用前需清洗、灭菌，步骤如下：A、用PBS浸泡微载体过夜；B、用PBS清洗微载体3遍；C、用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟，微载体经PBS清洗、高压灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，在反应器中用DMEM清洗微载体。

5.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述EDTA-胰酶细胞分散液为含有质量体积分数为0.25%的规格1：250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank's液，所述的规格1：250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。

6.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述细胞生长液的配方为：重量分数为90%-98%DMEM液、2%-10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8-7.6。

7.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述步骤四中的病毒培养液的配方为：重量分数分别是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8-7.6。

8.根据权利要求6或7所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。

9.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述步骤四中的生产用种毒接种量为0.01-0.5MOI。

10.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，其特征在于所述的生物反应器设定的参数为培养温度37℃、pH6.8-7.6、溶氧30%-60%、搅拌速度30-60rpm。