[发明专利]猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗的方法，可用于工业化生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗，替代传统的转瓶培养法。

背景技术

目前，国内猪传染性胃肠炎病毒疫苗生产都是依靠转瓶培养法实现。该传统工艺劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；细胞环境不均一，环境条件不易测量与监控，容易被环境污染；细胞不同批次间的差异大；难以扩大生产；细胞自身被细菌或其它病毒污染而致生产的疫苗或有质量隐患。另外，目前已经有利用生物反应器微载体生产狂犬病疫苗的报道，若能利用生物反应器微载体生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗可以广泛的应用于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体细胞培养生产猪传染性胃肠炎病毒疫苗的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的生产方法，包括以下步骤：

步骤一：生产用细胞的传代与培养：取生长良好的PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好单层PK15或ST细胞；

步骤二：生产用种毒的繁殖：在PK15细胞或ST细胞形成单层后，倒掉细胞生长液，将猪传染性胃肠炎病毒接种到步骤一的单层细胞上，猪传染性胃肠炎病毒的接种量与步骤一中细胞生长液的体积比为1:10，将细胞瓶迅速翻转使传染性胃肠炎病毒充分浸没单层细胞，置于37℃、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱中吸附1h，然后加入细胞维持液，置于37℃、体积百分含量为5%的二氧化碳培养箱培养，逐日观察，当75%～80%细胞出现病变时，收获病毒置于-15℃冰箱中，反复冻融细胞三次，此病毒液作为生产用种毒；

步骤三：PK15或ST细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤一中已形成良好单层PK15或ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵个细胞/ml～5×10⁶个细胞/ml的密度接种于生物反应器中进行培养；

步骤四：制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到5×10⁶个细胞/ml～5×10⁷个细胞/ml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤二中的生产用种毒，接毒前用含有10μg/ml胰酶的病毒培养液洗涤生产用种毒2-4次；

步骤五：病毒液的收获：待微载体上细胞全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置于-20℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器，容积为3L-3000L。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述微载体为Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3中的一种。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述微载体在使用前需清洗、灭菌，步骤如下：A、用PBS浸泡微载体过夜；B、用PBS清洗微载体3遍；C、用PBS浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟，微载体经PBS清洗、高压灭菌处理后，加入到已灭菌的生物反应器中，在反应器中用DMEM清洗微载体。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述EDTA-胰酶细胞分散液为含有质量体积分数为0.25%的规格1：250的胰酶和0.02%的EDTA的Hank's液，所述的规格1：250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述细胞生长液的配方为：重量分数为90%-98%DMEM液、2%-10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8-7.6。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述步骤四中的病毒培养液的配方为：重量分数分别是90%-95%DMEM液，5%-10%牛血清，终浓度为200-1000单位/ml的抗菌素，pH为6.8-7.6。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。

作为本发明的优选实施，进一步的技术方案是：所述步骤四中的生产用种毒接种量为0.01-0.5MOI，所述的MOI为病毒感染复数。