[发明专利]基于表位抗原肽的抗mtDNA抗体酶联免疫的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于临床自身抗体检测领域，具体涉及基于mtDNA为抗原的抗体mtDNA抗体酶联免疫检测方法及其在系统性红斑狼疮中的诊断应用。

背景技术

系统性红斑狼疮（SLE）是自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，血清中出现多种结合DNA/RNA的自身抗体和多系统受累为特征。研究显示细胞死亡后释放的DNA核蛋白质复合物增多或其清除障碍可能启动抗体产生而发病。已有研究发现SLE患者存在线粒体功能障碍，Peter Gergely Jr等发现狼疮病人外周血淋巴细胞的线粒体跨膜电位和线粒体活性氧产物均较正常对照组和类风湿关节炎组升高，从而导致线粒体功能障碍，ATP生成减少、细胞死亡和炎症发生。2004年，Brinkmann,V.等人定义了一种新的中性粒细胞死亡方式“NETosis”，不同于坏死和凋亡，NET样凋亡以释放免疫原性自身DNA-抗菌肽复合物为特点。之所以称之为“NETs”，是因为在这种死亡方式中，活化的中性粒细胞向胞外，释放出大量丝网状无定型的DNA。与正常人相比，SLE患者的中性粒细胞凋亡加速且清除障碍。NETs与SLE活动、狼疮肾炎和低补体等都有相关性。NETs本身作为自身抗原，诱导SLE患者产生自身抗体，加重组织器官损伤。NET中的DNA既包含核DNA也包含线粒体DNA，它们均具有潜在的致炎性。而在中性粒细胞激活的早期，细胞未死亡时，仅线粒体DNA通过NET以ROS依赖的方式，被主动释放入胞外；晚期，细胞陆续死亡，NET中可同时检测到核DNA和线粒体DNA。

抗双链DNA抗体(抗ds－DNA抗体)是系统性红斑狼疮（SLE）的标记性抗体之一，目前认为抗ds－DNA抗体除帮助诊断SLE外，尚可判断SLE的活动性及作为评估疗效的标记。已证明抗ds－DNA抗体与DNA结合成为免疫复合物，在肾小球基底膜或多种器官微血管沉积，或抗ds－DNA抗体直接作用于肾小球抗原或结合神经细胞表面的NMDAR2导致神经精神症状,此外该抗体还可以激活补体，而造成SLE患者的损害。但也有一些研究认为抗ds-DNA抗体与临床表现并不一致。

我们的研究发现我们检测了狼疮患者和正常人血浆中的抗mtDNA抗体和抗dsDNA抗体。我们发现抗mtDNA抗体滴度在SLE患者中明显增高（图1A），而且抗mtDNA抗体高的患者往往也具有高低度的抗dsDNA抗体（图1B)。抗mtDNA抗体可以显著诱导浆细胞样树突状细胞（pDC）释放干扰素α，我们对其中留取血样的病人进行了SLEDAI评分，以及干扰素诱导基因积分的计算。干扰素积分已被证实可以从一定程度上反应狼疮疾病的活动。通过相关性分析我们发现，SLE患者NET中mtDNA的含量与患者SLEDAI评分（图2A）和外周血单个核细胞干扰素积分（图2B）正相关。因此，抗mtDNA抗体是SLE的标记抗体，而且是一种致病性抗体。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种基于表位抗原肽的抗mtDNA抗体酶联免疫的检测方法，介于抗mtDNA抗体的致病性，其可替代抗ds-DNA抗体的检测，成为SLE的生物标记之一。

本发明的目的之二在于提供这种抗mtDNA抗体酶联免疫检测方法在系统性红斑狼疮中的诊断应用，用于判定SLE疾病危重度和转归。

本发明目的之三是提供抗mtDNA抗体的试剂和试剂盒。

本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的：

在前期首先在SLE患者血清中检测了抗mtDNA抗体

基于表位抗原肽的抗mtDNA抗体酶联免疫检测方法，具体步骤如下：

1）应用线粒体分离试剂盒（Thermo）抽提哺乳动物培养细胞线粒体；

2）应用DNA抽提试剂盒（Qiagen）提取线粒体DNA（mtDNA）；

3）DNA凝胶电泳检测mtDNA完整性（约16,500bp）。NanoDrop^TM1000分光光度仪检测mtDNA浓度（pg/ml）及质量（OD260/280>1.8）；

4）用DNA包被液（Pierce）将mtDNA包被于ELISA板上（Nunc），包被浓度5μg/ml，100μL每孔，4℃过夜；

5）4℃取出包被板，PBS洗板4次，1%明胶室温封闭1h；

6）清空封闭液，PBS洗板4次，加入待测血清（1:100稀释），室温孵育1—2h；

7）清空待测血清，PBS洗板4次，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG二抗（欧盟），室温孵育1h；