[发明专利]采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法

说明书

技术领域

本发明涉及柴胡和狭叶柴胡的分子生物学检测，具体地说，涉及一种采用特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。

背景技术

柴胡，为伞形科（Umbelliferae)芹亚科（Apioideae)柴胡属（Bupleurum L.）植物，始载于《神农本草经》，列为上品，是我国常用的大宗中药材。味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热、疏肝结语、升举阳气的功效，用于治疗感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂，脱肛等症。《中国药典》（2010版）收载的柴胡为柴胡（Bupleurum chinense DC.）、狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根。现代药理研究表明，具有解热、抗炎、抗病毒、抗细菌内毒、抗肿瘤、保肝、降血脂、抗惊厥、提高免疫力等功效。柴胡在中药制药等方面有重要应用，其内含有皂苷、挥发油、多糖、黄酮类、柴胡醇等多种成分，在解热、抗病毒、提高免疫力等方面效果明显。但柴胡属植物种类繁多，全球有120种，我国有40种17变种，仅供药用的柴胡属植物就有近30种。而且遍布全国各地有很多的习用品以及混伪品，如西北地区已开发5种柴胡，云南也发展了8种柴胡属植物为药用。

由于柴胡及狭叶柴胡的近似种以及混伪品过多，针对柴胡的基源和药材进行过深入的研究。传统的鉴定方法包括：基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等，现代的鉴别方法包括色谱法、质谱法、核磁共振法、差热分析法、扫描电镜技术、电泳等。柴胡及狭叶柴胡与柴胡属内其它种性状相似，形态学以及一些理化方法很难准确的鉴别其基源。而随着现代分子生物学研究的深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性（RFLP）分析、随机扩增多态DNA（RAPD）分析、间断简单序列重复（ISSR）标记、扩增片段长度多态性（AFLP）分析等技术得到了广泛的应用，但它们也存在着很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的解释亲缘物种间的演化关系，但不稳定，受实验条件限制较大；ISSR标记具有快速、简便、多态性高等优点，但其引物通用性差、扩增条件等需要针对性的设计；AFLP技术将RFLP和PCR技术完美结合，但其稳定性较差，且对操作者要求高、花费大。

本发明结合以上方法和技术的优点，依据分子标记技术的原理和原则，设计出一个特异性的引物，目的是提出一种特异性鉴定柴胡和狭叶柴胡的分子鉴别方法，为柴胡和狭叶柴胡的药材、中成药（蜜丸、水蜜丸）鉴定提供分子水平依据，并希望得到广泛的实际应用推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种可快速、准确地检测柴胡和狭叶柴胡的特异性引物及含有该引物的试剂盒。

本发明的另一目的是提供采用上述特异性引物PCR检测柴胡和狭叶柴胡的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种柴胡（Bupleurum chinense DC.）的PCR检测特异性引物对，其包括上游引物上游引物F1:5’-ATGCCTCCGCCCCGTTTGG-3’和下游引物R1:5’-TGCGTTTTCC GATCTCCGGT-3’。

为了实现本发明目的，本发明提供的一种狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的PCR检测特异性引物对，其包括上游引物F2:5’-TGTCGTCGGCCTCGGCCTG-3’和下游引物R2:5’-ACGACGAGGCACGGGAGGT-3’。

本发明还提供含有上述PCR引物对的用于检测柴胡和狭叶柴胡的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供所述试剂盒在检测柴胡和狭叶柴胡中的应用。

本发明进一步采用上述特异性引物PCR检测柴胡（或狭叶柴胡）的方法，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，使用上述引物F1-R1（或F2-R2），进行PCR扩增反应；

3）分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有柴胡（或狭叶柴胡）。

其中，PCR扩增反应体系以25μl计为：

PCR反应条件为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5minn，10℃10min。