[发明专利]用于检测EGFR基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因突变检测引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测EGFR基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法。 

背景技术

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于受体酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）erbB／HER家族的一个成员，EGFR的激活即磷酸化对调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、存活、血管生成及转移具有重要意义，研究表明，EGFR在许多恶性肿瘤中过高表达。 

近年来，随着医学分子生物学的发展，分子靶向治疗作为恶性肿瘤治疗的新手段，正日益受到临床工作者们的重视，因此，EGFR作为恶性肿瘤治疗的分子靶标而受到普遍关注。目前已开发出了吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor，EGFR-TKI），然而在临床中，有些患者对EGFR-TKI的治疗并不敏感或对该类药物产生耐药，故对EGFR-TKI耐药机制的探索成为国内外研究的热点。 

研究表明，这些靶向药物的敏感性及耐药性与肿瘤细胞EGFR突变密切相关。目前，在约半数耐药患者中发现了EGFR第20外显子T790M（T790M，threonine at position790）突变；而EGFR第19号外显子内缺失突变和第21外显子L858R突变则使突变细胞对药物亲和力增高，作用时间延长，对EGFR-TKI的敏感性增高。因此，在一线治疗的恶性肿瘤患者中检测EGFR基因突变具有重要的临床意义，是决定患者是否能够应用EGFR-TKI治疗的先决条件。 

目前检测EGFR突变主要通过直接测序法，该方法需要取得肿瘤组织标本，通过石蜡组织DNA提取，再进行PCR扩增、测序，最后对测序数据进行分析。这个方法对石蜡包埋组织标本要求高，要求标本中肿瘤组织含量达20%以上，检测敏感度低，检测流程复杂繁琐，对数据分析要求高，且目前无商用试剂盒，对实验室的仪器配备要求也较高。 

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测EGFR基因热点突变的引物，本发明还公开了包括有该引物的试剂盒及其使用方法。 

本申请的发明人根据EGFR基因的第19号外显子内缺失突变（EXON19缺失突变）、第20外显子T790M突变（EXON20T790M）和第21外显子L858R突变（EXON21L858R）设计并合成了特异性引物，以外周血为样本提取基因组DNA，可以快速检测EGFR基因中这三处热点突变，检测敏感度高，可更高效地筛查出适宜EGFR-TKI治疗方案的恶性肿瘤患者。 

根据本发明的实施例，提供了一种用于检测EGFR基因热点突变的引物，所述引物序列如下： 

SEQ ID NO:1 5’-ATCCCAGAAGGTGAGAAAGATAAAATTC-3’ 

SEQ ID NO:2 5’-CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’ 

SEQ ID NO:3 5’-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’ 

SEQ ID NO:4 5’-CGAAGCCACACTGACGTGC-3’ 

SEQ ID NO:5 5’-CGAAGGGCATGAGCCGC-3’ 

SEQ ID NO:6 5’-CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’ 

SEQ ID NO:7 5’-CAGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’ 

SEQ ID NO:8 5’-TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3’ 

SEQ ID NO:9 5’-CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’。 

根据本发明的实施例，还提供了一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒，其主要包括：1）引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9所示，PCR MIX反应液，针对不同突变进行酶切的限制性内切酶，BSA溶液， 酶切缓冲液，阴性对照品，阳性对照品，去离子水；2）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。 

优选的，上述引物的浓度均为5～10μmol/L。