[发明专利]猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

权利要求书

1. 猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，其特征在于：包括猪源衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.1;

猪源衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO.2；

猪源衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO.3。

2.猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的猪源衣原体上游引物0.4μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmmol/L的猪源衣原体下游引物0.4μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的10μmol/L的猪源衣原体MGB探针0.4μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 10μL；

灭菌去离子水 7.8μL；

合计19μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为猪源衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

所述阴性对照管，管内为无猪源衣原体感染猪的血液基因组DNA，体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

3.根据权利要求2所述猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得；

核苷酸序列为SEQ ID NO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.5的PCR下游引物按常规PCR进行扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得阳性重组质粒DNA。

4.根据权利要求2所述猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述DNA序列为SEQ ID NO.3的猪源衣原体MGB探针的5^，端标记有报告基团FAM，3^，端标记有非淬灭基团，同时探针上还连接有MGB修饰基团。

5.利用权利要求2所述试剂盒进行猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：采用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;

3）猪源衣原体实时荧光定量PCR扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系进行PCR管反应，条件：预变性95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s～34s 40个循环；在60℃ 30s进行荧光信号的采集；

4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。