[发明专利]B-raf基因V600E突变检测的方法

权利要求书

1.一种B-raf基因V600E突变检测的方法，其特征在于：

该方法含有：

(1)DNA提取：NP-40；chelex100；TRIS-HCL。

(2)DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶(无核酸外切酶活性)。

(3)PCR反应液：dNTPs，引物，DNA聚合酶，PCR Buffer，标记探针。

2.根据权利要求1所述的检测，引物具体信息如表1。

表1

引物名称序列F primerATGAAGACCTCACAGTAR primerATCCAGACAACTGTTCAAACTGAGeneral probeTTTTGGTCTAGCTACAGTGAA-BHQT probeFAM-ATCTCGATGGAGTGGG-PO4A probeTET-ATCTCGAAGGAGTGGG-PO4

3.根据权利要求1所述的检测，所使用的通用探针3’端使用BHQ标记。所使用的分型探针5’端使用FAM或TET标记，3’端最后一个核苷酸进行磷酸化处理。

4.根据权利要求1所述的检测，所使用的通用探针和分型探针全部处于引物的内部，并且无重叠的序列。所使用的分型探针位于通用探针下游第1个核苷酸位置开始。

5.根据权利要求1所述的检测，所使用的两条分型探针，必须存在一个核苷酸不同，并且保证两条分型探针在与野生型或者突变型杂交时，Tm值差异大于3℃以上。

6.根据权利要求1所述的检测，所使用的DNA聚合酶应该为无核酸外切酶活性，包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。

7.根据权利要求1中的检测，使用的PCR反应程序如表2：

表2

8.根据权利要求1中的检测，使用的PCR反应程序中PCR循环时的退火温度应该低于引物的Tm值。

9.根据权利要求1中的检测，使用的PCR反应程序中熔解分析时退火温度和解链起始温度应该低于通用探针和分型探针的Tm值。解链结束时的温度应该高于通用探针和分型探针的Tm值。