[发明专利]B-raf基因V600E突变检测的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于诊断B-raf基因V600E突变检测的方法，该方法可以检测患者体内分离出的DNA样本中B-raf基因是否存在某个特定的核苷酸变异。属于生命科学和技术领域。

背景技术：

B-raf基因是一种癌基因，与ARAF、RAFl(CRAF)基因同属RAF家族，位于7q34，长约190kb。由其翻译的B-raf蛋白由783个氨基酸组成，有CR1、CR2和CR3三个保守区。B-raf蛋白为丝苏氨酸蛋白激酶raf／mil家族成员，为Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中重要调节因子。B-raf蛋白位于MAPK／ERK途径的入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，从而调节细胞的分化、分裂。该通路被异常激活时，可促进细胞增殖、生长，最终导致肿瘤发生。研究表明，在人类的多种肿瘤中存在不同频率的B-raf基因突变，最常见于恶性黑色素瘤(30％-60％)、乳头状甲状腺癌(29％-83％)、结直肠癌(6％-15％)、肺癌(1％-3％)。序列分析B-raf突变形式共有40余种，主要集中在exon11、exon15两个区域，其中主要突变形式为位于1799核苷酸上T→A突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。B-raf基因V600E突变使B-raf蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。检测B-raf基因突变，对判断肿瘤的发生和发展以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义：(1)正常人血检中出现B-raf基因异常，提示存在肿瘤易感性；(2)大量研究表明，B-raf基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)靶向药物治疗显示无效，B-raf基因野生型肿瘤患者经帕尼单抗和爱比妥治疗疗效明显；(3)良性肿瘤患者若是检出B-raf基因突变，提示有肿瘤恶变的可能。因此，通过检测B-raf基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。目前，对B-raf基因V600E突变的检测主要采用DNA直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)等技术，操作繁琐费时且敏感度低。本试剂盒针对B-raf基因V600E突变区，特异性扩增相应突变模板DNA，该方法具有操作简便，灵敏度高，与突变检测“金标准”直接测序结果符合率高，闭关反应污染少等优点，适于在临床中普遍开展，对肿瘤分子分型、肿瘤分子靶向抗肿瘤药物疗效预测及肿瘤患者的临床个体化用药方案将具有重要的指导意义。

研究表明，B-raf基因突变形式共有40余种，主要集中在两个区域：①位于exon11上的的突变，约占10％，常为G463、G465、G468等的点突变；②位于exon15上的激活区突变约占90％，多为位于1799核苷酸上T→A突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。B-raf基因V600E突变使B-raf蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。B-raf基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)靶向药物治疗显示无效，B-raf基因野生型肿瘤患者经帕尼单抗和西妥昔单抗治疗疗效明显。因此，及时检测癌基因B-raf V600E突变发生情况，对肿瘤患者的临床个体化用药方案将具有重要的指导意义。

临床或实验室常用的B-raf突变检测方法主要有DNA直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)等，其中DNA直接测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点：检测的敏感性不够高：如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，用直接测序法检测不到突变样本的存在；费时，操作过程复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；测序结果的判读主观性强；一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。本试剂盒采用扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)结合Taqman荧光定量PCR技术，针对B-raf基因V600E突变区特异性扩增相应突变模板DNA。检测敏感性高，与突变检测“金标准”直接测序的结果符合率≥95％。此外本试剂盒还具有快速，操作简单，闭管反应污染少等优点，适于在临床中普遍开展。

基于上述内容，本方法用于肿瘤特异性癌基因B-raf基因V600E突变检测，可用于肿瘤的个体化分子诊断，进而指导肿瘤患者的临床个体化治疗方案。

发明内容：