[发明专利]一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻及其构建方法

权利要求书

1.一种可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，包括如下步骤：

（1）转基因受体藻的筛选和培养；

（2）筛选或设计调控miRNAs：根据表达量发生变化的miRNAs建立小RNA库，并从中筛选出预测的靶基因是与光系统Ⅱ相关的且表达量均显著上调的miRNAs，或根据影响光合效率的绿藻靶基因序列设计并合成调控该基因的人工miRNAs；

（3）分别构建含有步骤（2）的各调控miRNAs的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体；

（4）步骤（3）中得到的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体的遗传转化；

（5）转基因绿藻的筛选。

2.根据权利要求1所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，所述转基因受体藻为细胞壁缺陷型莱茵衣藻或细胞色素b缺陷型莱茵衣藻，其培养条件如下：采用TAP培养基，在温度为22-25℃、光照强度为90μE/m²/s的条件下连续光照通气培养，藻细胞对数生长期浓度为1-2×10⁶细胞/mL时离心收集。

3.根据权利要求2中所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）的调控miRNAs为预测的靶基因为细胞色素P450CYP3/CYP5/CYP6/CYP9亚家族的miR1150.3，预测的靶基因为磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的miR1166.1，靶基因为组成PSII复合体的OEE2蛋白的编码基因的人工调控miRNAs，靶基因为与叶绿体类囊体膜相关的VIPP1蛋白的编码基因VIPP1的人工调控miRNAs。

4.根据权利要求3所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤（3）是先将各调控miRNAs的成熟序列代替cre-MIR1162MI0006223的成熟序列，并在上游加上Nco I和Nhe I酶切位点，下游加上Pmac I和Pst I酶切位点，得到调控miRNAs表达骨架；再利用调控miRNAs表达骨架构建绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体。

5.根据权利要求4所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤（3）中绿藻核表达载体的构建方法：使用限制性内切酶Nhe I和Pmac I消化上述调控miRNAs表达骨架，得到相应的基因，将相应的基因插入经Pmac Ⅰ和Nhe Ⅰ消化的pH105载体并用EcoR Ⅰ酶切，获得调控miRNA基因表达框架，将调控miRNA基因表达框架插入pSP124的EcoR Ⅰ位点，即获得绿藻核表达载体。

6.根据权利要求4所述的可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，其特征在于，步骤（3）中绿藻叶绿体表达载体的构建方法：通过Nco Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切质粒p423切除aadA基因，获得质粒p423框架；通过Nco I和Pst I双酶切上述调控miRNAs表达骨架，获得相应的基因；将相应的基因与上述经过Nco I和Pst I双酶切的质粒p423框架通过连接酶进行连接获得质粒，使用EcoR Ⅴ和Sma Ⅰ双酶切前述质粒，获得相应的基因表达盒，将其与经EcoR Ⅴ双酶切的p423chl质粒用连接酶进行连接，通过Xho Ⅰ酶切筛选正向连接的质粒，即获得绿藻叶绿体表达载体。