[发明专利]一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻及其构建方法。

背景技术

在20世纪四十年代，Gafforn及其合作者首次发现栅藻利用其可逆氢酶，既能在厌氧条件下吸收氢气固定二氧化碳，又能在光照条件下放出氢气【Gaffron H,Rubin J.Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae.J.Gen.Physiol.,1942(26):219-240.】。随后在许多绿藻（如莱茵衣藻、小球藻等）均发现光合放氢现象。由于这些绿藻能从自然界最丰富的资源（光和水）中获得氢能，而且绿藻中氢酶的活性高达蓝藻和光合细菌氢酶活性的100倍以上，国际能源组织（IEA）在1998年的评估报告中，将绿藻光合制氢称为最有应用前景的生物制氢途径【Carolyn CE.Annual Report of IEA,1998:15-31.】。然而，由于绿藻氢酶活性受到光合放氧的抑制,使得其持续放氢时间只能维持几秒到几分钟，大大制约了绿藻光合制氢产业的发展前景。

“如何才能使绿藻细胞持续放氢”已经成为绿藻光合制氢产业的瓶颈问题。美国国家可再生能源实验室（NREL）和加州大学伯克利分校的Melis小组于2000年在缺硫条件下培养莱茵衣藻时，发现光合放氧速率发生可逆下降现象，但线粒体的呼吸耗氧却不受影响，使封闭的莱茵衣藻生物反应器中的藻细胞处于厌氧环境，解除了衣藻光合放氧对氢酶的抑制作用，从而使持续放氢时间达到70小时以上，莱茵衣藻的放氢效率大大提高【Melis A,Zhang L,Forestier M et al.Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algal Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol.2000(22):127-135.】。由此引起人们对绿藻缺硫放氢现象的极大关注。进一步研究表明：当莱茵衣藻在缺硫条件下培养时，其藻细胞光合系统II（PSII）的活性受到抑制，进一步诱导呼吸耗氧，从而解除氧对绿藻氢酶的抑制，实现绿藻持续放氢过程。基于绿藻能在缺硫环境下持续放氢的理论，目前国际上设计出的绿藻光合制氢生物反应器均是使用两步交替法制氢，即在有硫培养基中生长，在去硫培养基中放氢，这样交替更换培养基来达到持续产氢的目的。然而，由于绿藻与培养基分离困难，将藻固定化后其生长和放氢能力又会大大下降，所以这种制氢途径没有产业化应用前景。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻的构建方法；本发明要解决的另一技术问题是利用上述方法构建一种可持续光合产氢的转调控miRNA基因藻。

本发明提供了一种可连续光合放氢的转调控miRNAs基因绿藻的构建方法，包括如下步骤：

（1）转基因受体藻的筛选和培养；

（2）筛选或设计调控miRNAs：根据表达量发生变化的miRNAs建立小RNA库，并从中筛选出预测的靶基因是与光系统Ⅱ相关的且表达量均显著上调的miRNAs，或根据影响光合效率的绿藻靶基因序列设计并合成调控该基因的人工miRNAs；

（3）分别构建含有步骤（2）的各调控miRNAs的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体；

（4）步骤（3）中得到的绿藻核表达载体或绿藻叶绿体表达载体的遗传转化；

（5）转基因绿藻的筛选。

所述转基因受体藻为细胞壁缺陷型莱茵衣藻或细胞色素b缺陷型莱茵衣藻，其培养条件如下：采用TAP培养基，在温度为22-25℃、光照强度为90μE/m²/s的条件下连续光照通气培养，藻细胞对数生长期浓度为1-2×10⁶细胞/mL时离心收集。

所述步骤（2）的调控miRNAs为预测的靶基因为细胞色素P450CYP3/CYP5/CYP6/CYP9亚家族的miR1150.3，预测的靶基因为磷脂酰甘油磷酸合成酶基因的miR1166.1，靶基因为组成PSII复合体的OEE2蛋白的编码基因的人工调控miRNAs，靶基因为与叶绿体类囊体膜相关的VIPP1蛋白的编码基因VIPP1的人工调控miRNAs。