[发明专利]羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用

权利要求书

1.一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）自杀性同源重组质粒的构建

①以羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；

P1：5′-GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3′；

P2：5′-TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3′；

P3：5′-GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3′；

P4：5′-AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3′；

②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，P1和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段ΔznuA；

③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΔznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；

（2）羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选

①将自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA导入羊布鲁氏菌M5的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的TSA-YE平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB-YE培养基中培养，松弛质粒抗性；

②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA；

所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下：胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+终浓度为质量体积比7%的蔗糖。

2.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤（1）①中所述的PCR的条件为94℃2min；98℃10s、56℃30s、68℃1.5min，30个循环；68℃5～10min终延伸。

3.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤（1）②中所述的Overlap PCR的条件为94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30个循环；68℃5～10min终延伸。

4.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤（2）①中所述的导入的方式为通过电转化方式导入。

5.根据权利要求4所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：所述的电转化的条件为1mm电极杯，1.8kv，400Ω。

6.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤（2）①中所述的氯霉素在所述的TSA-YE培养基中的终浓度为5μg/mL。

7.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤（2）①中所述的培养的条件为37℃、200r/min摇床上培养36～48h；

步骤（2）②中所述的培养的条件为37℃培养48～96h。

8.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤（2）①中所述的PCR鉴定为通过引物P1和P4进行鉴定；

所述的PCR鉴定的条件如下：94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30个循环；68℃5～10min。

9.一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA，其特征在于：通过上述制备方法得到。

10.权利要求9所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。