[发明专利]羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于重组细菌疫苗领域，特别涉及一株羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，防控该病一直是以应用疫苗进行预防为主。布鲁氏菌疫苗种类较多，传统弱毒苗造价便宜、免疫保护持续时间长、免疫保护效率高，但存在毒性较大易返祖、无法区分人工免疫与自然感染等缺点；重组蛋白疫苗与DNA疫苗具有安全性高、制备工艺简单、方便储藏运输等优点，但也存在免疫效果差、保护性有限的缺点；灭活疫苗虽在使用时较安全，但由于保护期短、制备成本高而难以广泛应用。目前，用于布鲁氏菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号弱毒菌株（S19）和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号（M5）弱毒菌株和猪型2号（S2）弱毒菌株，但是弱毒疫苗同样存在缺陷，这些光滑型布鲁氏菌弱毒疫苗免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，很难与野毒株布鲁氏菌感染相区分从而干扰常规布鲁氏菌病的诊断。若广泛应用这样的疫苗就对该病流行病学调查、探查疫源产生很大的障碍，除此之外，现有的布鲁氏菌的减毒活疫苗都会对动物产生不同程度的副作用，再引起动物轻度流产的同时也会感染人类。所以构建安全性高、无返祖、能区分自然感染与人工主动免疫、保护性能好的布鲁氏菌标记弱毒疫苗是当务之急。

此外，布鲁氏菌的生存和增殖必须依赖于环境或宿主之中的多种过渡金属离子。尤其锌离子，是布鲁氏菌结构所必须的金属离子，是菌体内催化反应的辅助因子，因此，获得适当程度的锌对细菌来说非常重要。但是由于宿主体内游离的锌离子含量非常少，为了摄取足够的锌保证细菌自身的新陈代谢，并在宿主体内大量增殖，各种细菌如布鲁菌进化出几种类型的蛋白参与摄取和转运锌离子，这些转运锌离子的蛋白操纵系统被命名为ZnuABC，此系统包括znuA、znuB、znuC基因编码的多种蛋白，其中ZnuA是一种细胞周质-溶质结合蛋白，目前对该基因的机理研究仍较少，仅推测该ZnuA蛋白与布鲁菌毒力因子相关。本研究旨在获得一株既能减低毒力、提高安全性，又能维持疫苗的高效免疫原性的布鲁氏菌病弱毒疫苗，我们将表达ZnuA蛋白的基因敲除，以获得一株羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）重组菌株M5-ΔznuA及制备方法和应用，为制备更为安全有效的新型基因工程疫苗奠定基础。

发明内容

为了克服上述现有疫苗的缺点与不足，研究布鲁氏菌znuA基因缺失对疫苗菌株的影响。

本发明的首要目的在于提供一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法。

本发明另一目的在于提供通过上述制备方法得到的羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA。

本发明再一目的在于提供上述羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备方法，包括以下步骤：

（1）自杀性同源重组质粒的构建

①以羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；

P1：5′-GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3′（横线部分为KpnI酶切位点）；

P2：5′-TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3′；

P3：5′-GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3′；

P4：5′-AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3′（横线部分为Sac1酶切位点）；

②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，P1和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段ΔznuA；

③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΔznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；

（2）羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选