[发明专利]一种检测人外周血中T淋巴细胞活化期标记物的方法

权利要求书

1.一种检测人外周血中T淋巴细胞活化标记物的方法，其特征在于，其包括：首先对外周血进行培养和刺激；然后将培养刺激后的外周血进行染色处理，并对染色后样品进行红细胞裂解和洗涤；最后将洗涤后的样品进行定量流式检测；同时测定QuantiBRITE PE荧光得到标准曲线，根据标准曲线换算所测样品中T淋巴细胞表面CD69、CD71及CD25的表达量。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人外周血中T淋巴细胞活化标记物为CD69、CD25和CD71。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）采集检测样本；

采集静脉外周血2-3ml，EDTA抗凝，室温放置；

（2）荧光染色；

①取抗凝全血，加入适量RPMI1640培养基及ConA刺激剂，使ConA刺激剂的终浓度为10-12ng/ml，37℃，5%CO₂培养24-48h；

②取培养后样品离心，吸弃上清培养基；

③加入antihuman-CD3-PerCP-5.5、antihuman-CD69PE、antihuman-CD25PE和antihuman-CD71PE抗体，避光孵育，加入红细胞裂解液，室温下避光静置10-15min；

④离心弃上清，加入PBS洗涤，离心弃上清，该过程重复2-3次；

加入100μl PBS重悬细胞，上机检测；

（3）样本检测；

①配制标准微球溶液：QuantiBRITE PE微球测定管中加入1ml PBS，充分混匀后待测。

②流式细胞仪检测QuantiBRITE PE标准微球荧光强度：用前向角设阈值，前向角/侧向角设门，建立荧光通道2(FL2)直方图；

③根据4种标准微球的标定PE分子数(X)和实际测定的平均荧光强度(Y)，建立定量分析的标准曲线：logY=AlogX+B；

④流式细胞仪测定样品T细胞的CD69、CD25和CD71的荧光强度；将荧光强度代入标准曲线，计算得到CD69、CD25和CD71结合的PE分子数。

⑤根据有效荧光素/蛋白(F/P)比值，换算得到每个T淋巴细胞上CD69、CD25和CD71表达量。