[发明专利]一种检测人外周血中T淋巴细胞活化期标记物的方法

说明书

技术领域

本发明属医学检测技术领域，具体涉及一种检测人外周血中T淋巴细胞活化标记物的方法。尤其是应用定量流式细胞术同时检测人外周血中T淋巴细胞活化标记物CD69、CD25和CD71的方法。

背景技术

研究显示，免疫抑制剂的安全范围（即治疗窗）较窄，血药浓度等药动学参数个体间和个体内变异大，易发生感染或排异等严重不良反应，需要进行治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）和个体化给药。目前对免疫抑制剂的治疗药物监测通常是进行血药浓度监测。但是，近年来研究发现相同的血药浓度会产生不同的药物效应。因此，越来越多的国内外学者提出需进行免疫药效学监测，通过检测免疫细胞功能来调整给药方案，提高免疫抑制剂的安全性和有效性。

CD69、CD25和CD71分别是T淋巴细胞活化早、中、晚期的标志物，对其进行监测可以直接反映人体的免疫抑制状态，为及时调整免疫抑制剂的用药方案提供依据。传统流式细胞术(Flow cytometry，FCM)的分析结果通常用荧光强度、平均荧光强度(Mean fluorescence intensity，MFI)、相对荧光强度(Relative fluorescence intenstity RFI)、阳性或阴性细胞百分率等方式表达。然而，上述结果未能表达出细胞或颗粒上的某种抗原或分子的绝对数量。此外，T淋巴细胞活化抗原CD69、CD25和CD71的表达是一个连续变化过程，而荧光强度的定性分析无法准确反映其动态变化特点，并且各实验室间的检测结果亦无法直接进行比较。

基于上述原因，本申请的发明人拟提供一种快速，准确的同时测定人外周血中T淋巴细胞表面抗原CD69、CD25和CD71表达量的方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术对T细胞表面抗原测定的不足，提供一种可以绝对定量人外周血中T淋巴细胞表面抗原的方法。该方法能快速、准确定量人外周血中T淋巴细胞活化标志物CD69、CD25和CD71的表达量(Antibody capacity，ABC)，为临床个体化用药提供准确的免疫药效学依据。

本发明采用定量流式细胞术检测T淋巴细胞活化标志物CD69、CD25和CD71的表达量。该法是通过检测标准微球的荧光强度及已知的荧光分子数建立标准曲线，通过标准曲线求得每个待测细胞上的平均荧光素分子数。根据每个抗体分子所结合的荧光分子数，计算每个细胞上抗体结合量(Antibody binding capacity，ABC)，从而根据抗原抗体结合的原理，反映细胞表面抗原的表达量。

本发明方法中，首先对外周血进行培养和刺激；然后将培养刺激后的外周血进行染色处理，并对染色后样品进行红细胞裂解和洗涤；最后将洗涤后的样品进行定量流式检测。

本发明方法中，所使用的定量流式标准微球是QuantiBRITE PE微球。该微球是一种水溶性小球，以藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)分子包被（或标记），其中含4种不同荧光水平。使用时，根据产品说明书中标称的每个微球上PE分子数量及流式细胞仪测得的实际荧光强度，可建立标准曲线。

具体而言，本发明的检测人外周血中T淋巴细胞活化标记物的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）采集样本

采集人外周静脉血2-3ml，K₂EDTA抗凝；

（2）荧光标记

①取100μl抗凝全血，加入适量RPMI1640细胞培养基和ConA刺激剂，使ConA刺激剂的终浓度为10-12ng/ml；37±1℃，5%CO₂培养箱中培养24-48h；

②取培养后样品离心，弃上清培养基；

③加入antihuman-CD3-PerCP-5.5、antihuman-CD69PE、antihuman-CD25PE和antihuman-CD71PE抗体各2μl，避光孵育30-45min，然后加入3-5ml红细胞裂解液，避光静置10-15min；

④离心后弃上清，再加入2-3ml PBS洗涤2-3次，弃上清液；

⑤加入100-200μl PBS重悬细胞，待测；

（3）检测分析

①配制标准微球溶液：在含QuantiBRITE PE微球的测定管中加入1ml PBS，混匀；