[发明专利]重组蛋白质的纯化方法

权利要求书

1.一种从包含重组蛋白和其相关蛋白的混合物中纯化该重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括依次进行的下列步骤：

A.用第一种平衡缓冲液使重组蛋白结合到离子交换介质上，其中第一种平衡液处于第一电导率和pH，

B.用第二种平衡缓冲液继续平衡已结合蛋白的离子交换介质，其中第二种平衡液处于第二电导率和pH，

C.用不同pH的洗涤液洗涤离子交换介质，从而从离子交换介质上洗脱下第一类相关蛋白，其中洗涤液处于第三电导率和pH是逐步增加的，

D.用第一种洗脱液洗脱离子交换介质，从而从离子交换介质上洗脱下目的重组蛋白，其中第一种洗脱液处于第四电导率和pH，

E.用第二种洗脱液继续洗脱离子交换介质，从而从离子交换介质上洗脱下第二类相关蛋白，其中第二种洗脱液处于第五电导率和pH，

其中，所述第二种平衡缓冲液的电导率比第一种平衡缓冲液低，但pH两者相同，所述洗涤液的电导率比第一种平衡缓冲液低，但pH高于第一和/或第二种平衡缓冲液,所述第一种洗脱液的pH比洗涤液高，但电导率相同，所述第二种洗脱液的pH和/或电导率比第一种洗脱液高，所述的重组蛋白是抗体，所述第一类相关蛋白是重组蛋白的酸性突变体，为在CEX-HPLC上保留时间小于目标蛋白的那一类物质，所述第二类相关蛋白是重组蛋白的碱性突变体，为在CEX-HPLC上保留时间大于目标蛋白的那一类物质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换介质是阳离子交换介质。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换介质是结合在不同基质上的功能基团为SO₃^-的填料。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一类相关蛋白和目的重组蛋白的洗脱是通过改变洗涤液和第一种洗脱液的pH来实现的。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述洗涤液和第一种洗脱液的pH是通过调整两种不同pH的缓冲盐的混合比例来实现改变的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗涤液和第一种洗脱液的pH是通过25％Na₂HPO₄ pH7.5+75％Na₂HPO₄ pH9.3-9.4改变到15％Na₂HPO₄pH7.5+85％Na₂HPO₄ pH9.3-9.4来实现改变的。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤A-D中，pH是逐步上升的。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白和相其关蛋白是具有不同的PI，第一类相关蛋白PI要低于重组蛋白PI，重组蛋白PI要低于第二类相关蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗体结合HER2，具体是曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)，以及所有结合HER2抗原的重组抗体。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括将包含所述重组蛋白和其相关蛋白的混合物在离子交换层析方法之前、之中或之后经过一次或多次进一步的纯化步骤，来获得该重组蛋白的均一制备物。