[发明专利]一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法

权利要求书

1.一种酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，该酵母菌分离、筛选的方法包括以下步骤：

步骤一、通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定；

步骤二、通过采用杜氏管发酵法、碳源同化采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35℃下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定；

步骤三、通过酵母菌4-4A总DNA的提取、rDNA-ITS区域PCR扩增、PCR产物回收纯化、产物连接转化、阳性克隆检测、ITS片段测序及分析，实现ITS序列的分析。

2.如权利要求1所述的酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，步骤一的具体方法如下：

第一步，酵母宏观培养特征

先将酵母菌接在NYDA斜面上，25℃培养2天～3天活化，然后取菌体1环接入含40mlNYDB液体培养基的100ml三角瓶中，25℃恒温静置培养3天；

第二步，酵母菌落形态观察

将菌株活化培养2天～3天后，取一环接于NYDB培养基中，28℃振荡培养24小时，稀释后涂平板于NYDA固体培养基，28℃培养3天；

第三步，假菌丝的形成

将倒好的PDA平板倒置1天～2天使其表面干燥，用活化好的酵母划线接种2条～3条，盖上灭菌的盖玻片，28℃下培养5天后取盖玻片观察划线两旁假菌丝形成情况及形态；

第四步，酵母菌子囊孢子的观察

将已活化的酵母菌株接种至Gorodkowa琼脂培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、PDA培养基，25℃培养3天，镜检子囊孢子形成情况，凡未见孢子的时间延长至4周～6周，每周检查子囊孢子出现情况；

第五步，掷孢子镜检

将倒好的PDA平板放置2天，然后将酵母菌株沿垂直直径方向划线接种，倒置放于另一个PDA平板上，放置一个无菌载玻片，将紧扣的两个培养皿置于25℃培养三周，取出载玻片观察载玻片上的孢子。

3.如权利要求1所述的酵母菌分离、筛选的方法，其特征在于，在步骤二中，生理生化指标测定具体方法如下：

第一步，糖发酵

将需要测试的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8种糖用蒸馏水配成质量分数20％的母液，细菌过滤器过滤后放在4℃冰箱内备用；

采用杜氏管发酵法，取口径12mm的试管，每管加入7.2ml黄豆芽汁，将杜氏管倒置于大试管中包扎后121℃灭菌20min备用；分别于每支试管内注入20％的糖母液0.8ml，并使小管内外的糖扩散均匀，再将酵母分别接种于含糖试管中，28℃静置培养7天后观察；凡不产气的试管可延长培养至10天再观察，杜氏管内有气泡计为阳性，无气泡计为阴性；

第二步，碳源同化

采用液体培养法，在含0.5%碳源的基础培养基中，接入酵母种子液，浓度达到10⁴个/ml，以加入葡萄糖的基础培养液为对照，28℃振荡培养，观察生长情况；

第三步，氮源同化

挑取底部较平整的灭菌培养皿，取20ml无氮源固体基础培养基熔化，冷却到50℃后注入酵母菌悬液1ml摇匀；待培养基凝固后，28℃倒置5小时；然后添加氮源并在培养皿底部标记氮源名称，28℃培养2天，观察酵母菌的生长情况，接种前，酵母菌需在无氮源基础培养基中进行饥饿培养；

第四步，35℃下生长情况

将活化的酵母菌株划线接种于NYDA斜面，35℃下培养3天～4天后观察生长情况；

第五步，致死温度

将NYDB液体培养基装入口径12mm的试管中，每管4ml；再加入酵母菌液1ml，水浴加热，温度上升到预定值时计时10min；28℃过夜后涂板确定酵母是否全部死亡；从30℃开始，5℃为梯度递增，直到酵母全部死亡的温度，然后从上一个温度以1℃递增即可；

第六步，耐乙醇能力

向试管中加入NYDB液体培养基和无水乙醇，先加NYDB灭菌后再加无水乙醇；将酵母菌株的培养物稀释后取1ml加入上述培养基中，28℃培养3天～5天，在600nm下测定OD值；

第七步，生长曲线测定

采用NYDB液体培养基，将酵母菌株活化，取两环接种于50ml种子培养基中，28℃培养24小时，取1ml种子液接入发酵培养基中，接入的体积比为50ml/250ml，28℃，200r/min摇床培养，每2小时取样稀释20倍后在600nm吸光度下测定其OD值，根据时间和菌液浓度绘制酵母的生长曲线图。