[发明专利]一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于芒果炭疽病防治技术领域，尤其涉及一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法。

背景技术

目前，炭疽病在采前和采后危害芒果，造成很大的产量和品质损失，是芒果生产上的重要病害之一，其病原菌主要为胶孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides(Penz)Penz.&Sacc.）。长期以来，该病害的田间防治主要依赖化学杀菌剂，随着苯并咪唑类化学药剂的长期大量使用，胶孢炭疽菌已经对该类杀菌剂产生了抗药性，使得防效下降。病原菌的潜伏侵染会造成芒果在采后流通过程中的大量损失，采后炭疽病的防治也需要化学药剂，随着人们对环境保护和食品安全越来越重视，研发更加安全、环保的芒果炭疽病采前采后防治新技术，如生物防治，显得更加迫切。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种酵母菌分离、筛选的方法及生防菌剂的制备方法，旨在解决现有的芒果炭疽病防治使用化学杀菌剂提高了病菌的抗药性，不利于环境的保护和食品安全性的问题。

本发明实施例是这样实现的，本发明实施例的酵母菌分离、筛选的方法，该酵母菌分离、筛选的方法包括以下步骤：

步骤一、通过酵母宏观培养特征、酵母菌落形态观察、假菌丝的形成、酵母菌子囊孢子的观察、掷孢子镜检对酵母形态学鉴定；

步骤二、通过采用杜氏管发酵法、碳源同化采用液体培养法、氮源同化、接种于NYDA斜面35℃下生长情况、致死温度和耐乙醇能力，对生长曲线测定，实现生理生化指标的测定；

步骤三、通过酵母菌4-4A总DNA的提取、rDNA-ITS区域PCR扩增、PCR产物回收纯化、产物连接转化、阳性克隆检测、ITS片段测序及分析，实现ITS序列的分析。

进一步，步骤一的具体方法如下：

第一步，酵母宏观培养特征

先将酵母菌接在NYDA斜面上，25℃培养2天～3天活化，然后取菌体1环接入含40mlNYDB液体培养基的100ml三角瓶中，25℃恒温静置培养3天；

第二步，酵母菌落形态观察

将菌株活化培养2天～3天后，取一环接于NYDB培养基中，28℃振荡培养24小时，稀释后涂平板于NYDA固体培养基，28℃培养3天；

第三步，假菌丝的形成

将倒好的PDA平板倒置1天～2天使其表面干燥，用活化好的酵母划线接种2条～3条，盖上灭菌的盖玻片，28℃下培养5天后取盖玻片观察划线两旁假菌丝形成情况及形态；

第四步，酵母菌子囊孢子的观察

将已活化的酵母菌株接种至Gorodkowa琼脂培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、PDA培养基，25℃培养3天，镜检子囊孢子形成情况，凡未见孢子的时间延长至4周～6周，每周检查子囊孢子出现情况；

第五步，掷孢子镜检

将倒好的PDA平板放置2天，然后将酵母菌株沿垂直直径方向划线接种，倒置放于另一个PDA平板上，放置一个无菌载玻片，将紧扣的两个培养皿置于25℃培养三周，取出载玻片观察载玻片上的孢子。

进一步，在步骤二中，生理生化指标测定具体方法如下：

第一步，糖发酵

将需要测试的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8种糖用蒸馏水配成质量分数20％的母液，细菌过滤器过滤后放在4℃冰箱内备用；

采用杜氏管发酵法，取口径12mm的试管，每管加入7.2ml黄豆芽汁，将杜氏管倒置于大试管中包扎后121℃灭菌20min备用；分别于每支试管内注入20％的糖母液0.8ml，并使小管内外的糖扩散均匀，再将酵母分别接种于含糖试管中，28℃静置培养7天后观察；凡不产气的试管可延长培养至10天再观察，杜氏管内有气泡计为阳性，无气泡计为阴性；

第二步，碳源同化

采用液体培养法，在含0.5%碳源的基础培养基中，接入酵母种子液，浓度达到10⁴个/ml，以加入葡萄糖的基础培养液为对照，28℃振荡培养，观察生长情况；

第三步，氮源同化

挑取底部较平整的灭菌培养皿，取20ml无氮源固体基础培养基熔化，冷却到50℃后注入酵母菌悬液1ml摇匀；待培养基凝固后，28℃倒置5小时；然后添加氮源并在培养皿底部标记氮源名称，28℃培养2天，观察酵母菌的生长情况，接种前，酵母菌需在无氮源基础培养基中进行饥饿培养；

第四步，35℃下生长情况

将活化的酵母菌株划线接种于NYDA斜面，35℃下培养3天～4天后观察生长情况；

第五步，致死温度