[发明专利]一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法

权利要求书

1.一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，该热带植物多糖多酚小RNA提取方法包括以下步骤：

步骤一、采样热带植物叶片，冻入液氮，-80℃保存；

步骤二、准备小RNA提取的试剂，CTAB裂解缓冲液、PEG8000沉淀缓冲液、EDC交联缓冲液、miRNANorthernblotting杂交缓冲液、7%dPAGE、WashingBuffer；

步骤三、按照小RNA提取的预处理、Trizol抽提、分级沉淀高分子量RNA、沉淀小RNA，提取小RNA；

步骤四、按照17%dPAGE分离、转膜及交联、miRNA杂交及洗膜、小RNA杂交及洗膜、曝光及保存，实现RNA杂交；

步骤五、miRNAstem-loopRT-PCR扩增；

步骤六、开展多糖多酚植物小RNA的提取以及检测分析。

2.如权利要求1所述的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，在步骤二中，提取小RNA的试剂如下：

CTAB裂解缓冲液：4M异硫氰酸胍，2%w/vCTAB，100mMTris-HCLpH8.5，25mMEDTA，2MNaCl，2%w/vPVP-40，and2%v/v2-巯基乙醇；

PEG8000沉淀缓冲液：20%w/vPEG8000，1MNaCl；

EDC交联缓冲液12ml：122.5μl12.5M1-甲基咪唑pH8.0，0.373g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐；

miRNANorthernblotting杂交缓冲液：5×SSC，20mMNaHPO4pH7.2，7%SDS，3×Denhardt`s溶液；

17%dPAGE：尿素12.6g，水1.25ml，10×TBE1.5ml，Acr/Bis30%17ml，在微波炉中溶解尿素，待冷却后加入240μl10%AP，混匀后再加入10μlTEMED；

WashingBuffer：2×SSC，0.1%SDS。

3.如权利要求2所述的热带植物多糖多酚小RNA提取方法，其特征在于，在步骤三中，小RNA提取的具体方法如下：

第一步，预处理：

取2g～3g叶片液氮研磨后将粉末转入DEPC处理过的50ml的离心管中，加入20ml的CTAB-PVPP裂解缓冲液，涡旋不少于30s后将裂解产物放在室温3分钟～5分钟，然后12000g4℃离心5min；

第二步，Trizol抽提：

离心后的上清转入一干净的50-ml离心管，加入等体积的Trizol试剂，充分涡旋后室温放置5min～10min；加入4ml氯仿:异戊醇，氯仿:异戊醇的比值为24:1，涡旋后静置3min离心，1,2000g4℃离心10min；

第三步，分级沉淀高分子量RNA：

离心后上清转入另外50ml离心管，65℃孵育15min，然后加入等体积的PEG8000沉淀缓冲液，涡旋后马上冰浴30min～45min后离心10min沉淀高分子量RNA；

第四步，沉淀小RNA：

离心后的上清液加入1/10体积的3MNaAcpH5.2和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，1,2000g4℃离心20min，沉淀用80%的乙醇洗涤1次～2次，DEPC水溶解后放入-80℃备用。