[发明专利]一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于RNA提取技术领域，尤其涉及一种热带植物多糖多酚小RNA提取方法。 

背景技术

植物小RNA是一种负调控因子，根据序列的特异性在转录和转录后水平调控基因表达、DNA和组蛋白甲基化以及抵抗外源遗传因子，如病毒、转座子或转基因的入侵。依据小RNA的生物合成特点，植物小RNA主要分为两类：植物小干扰RNA（siRNA，small/short interfering RNA)和微RNA（miRNA，miRNA)。二者长度约为20～25nt，均由类似RNAe III的核酸内切酶Dicer（或Dicer类似蛋白）加工产生，它们的形成既有联系又有区别。微RNA（或miRNA）是一种长度介于20-24nt的单链小分子RNA，由Ⅲ型RNAeDicer从含有茎环结构的内源转录本中切割产生。siRNA途径是由dsRNA引发的，而miRNA途径由内源性hpRNA诱导。siRNA和miRNA都由DCL（或Dicer类似蛋白）剪切形成，其中与mRNA互补的链结合RNA诱导的沉默复合体。 

miRNA基因广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独 立的基因座位(1ocus)，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构(hairpin)。miRNA与靶基因绝大多数情况下以不完全互补的方式起作用。 

小干扰RNA（siRNA）来自长的完全互补的双链RNA，如病毒RNA，反向重复序列或由依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）合成的dsRNA。在拟南芥中siRNA还可以分成反式作用siRNA（trans-acting siRNA，tasiRNA）、内源顺反转录本siRNA（natural cis-antisense siRNA,nat-siRNA）、异染色质siRNA（Heterochomatic siRNA，hcsiRNA），它们的RNA沉默途径各异。其中反式作用siRNA研究比较清楚，tasiRNA是由内源TAS转录本产生，其生物发生途径将miRNA和siRNA生物途径有机融合，产生级联tasiRNA，其中tasiR-ARF3和tasiR-ARF4是两个保守的siRNA序列，参与拟南芥叶片的极性发育，在玉米中ragged seedling2编码AGO7-like蛋白，产生的ta-siARFs参与玉米极性发育。 

获得高质量的小RNA是后续研究其表达和功能的前提条件。目前，模式植物的小RNA提取方法已经非常成熟，采用Trizol或者miRNA kit可以获得很好的结果。然而，对于热带植物而言，体内含有多糖多酚，一般的裂解液既不能去除多糖也不能去除多酚，所以无法很好的提取多糖多酚植物的小RNA，阻碍了其分子生物学方面研究的进展。在RNA提取过程中，细胞破碎后多糖多酚物质与RNA发生作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。因此，摸索一种适合多糖多酚植物的小RNA提取方法对于后续的研究至关重要。 

Trizol是植物中应用最广泛、最简便的商业化总RNA提取方法，开发Trizol作为植物小RNA提取方法是最简便和适用的技术。但是，热带植物含有高浓度的多糖多酚，还有单宁以及其他次生物质。在植物材料匀浆时，多酚物质氧化成醌类物质后与RNA稳定地结合；多糖理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开，沉淀后与RNA一起产生凝胶状沉淀。而Trizol主要成份是异硫氰酸胍和苯酚，即使添加了如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸之类的防止酚氧化的试剂也很难提取。因此，在前期样品处理的时候去除这些杂质是后续提取高质量小RNA的关键。