[发明专利]一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法

权利要求书

1.一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法，其特征在于：包括葎草雄性特异性引物序列，其特异性引物序列为：

上游(SCARF)：5’-TTGAAGAAATCTCATCCTCAAAGA-3’；

下游(SCAP R)：5’-GACCTTGGCCACAGGAATAG-3’；

该方法的具体实施过程为：利用上述设计的特异引物序列，以葎草个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，反应组成为1U的Taq DNA聚合酶，2μL的dNTP，100-200ng的基因组DNA，其中含雄性特异上下游引物各0.1μmol/L，在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增：95℃预变性5min后，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30个循环，最后72℃延伸7min，扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，DL2000marker作分子量标记，出现大小为153bp目的带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法，其特征在于：针对葎草性别特异AFLP分子标记的筛选的具体包括以下几个步骤：

(1)提取葎草的基因组DNA：选择已开花可以通过花的结构鉴别雌雄的葎草，取适量叶片放入研钵中，加液氮迅速磨成粉末，转入离心管中；加入预热至65℃的CTAB抽提缓冲液，65℃温浴60min；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V/V/V)，10000×g，室温下离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1，V/V)，混匀，10000×g，室温下离心10min；取上清液，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃静置1h；用细玻璃棒挑出絮状DNA沉淀，放入1.5mL离心管中，用70％的酒精漂洗两次，室温干燥；加入500μL1×TE缓冲液，10000×g离心10min，将上清液转入新离心管中，加入RNase(10mg/mL)，37℃保温1h，用等体积的氯仿：异戊醇抽提；取上清液，加入2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃静置1h；7000×g离心10min，弃去上清液，沉淀用70％的乙醇漂洗2次，室温干燥；1×TE溶解，-20℃下储存备用；将提取的DNA在紫外分光光度计下测定OD₂₆₀和OD₂₈₀进行质量检测，每一方法重复3次；将DNA原液稀释后，用1×TAE，0.8％琼脂糖凝胶，5V/cm电泳0.5h进行电泳检测；

(2)基因组DNA的AFLP分析：基因组DNA的AFLP分析主要有如下步骤：

(2a)对基因组DNA模板进行酶切：用1.25U/μL EcoR I/Mse I酶混合物37℃消化100ng模板DNA7h，再用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于70℃孵育15min灭活限制性内切酶；

(2b)将特异接头连接到酶切片段上：向上面的酶切反应混合液中加入12μL接头混合物和1.5U T4DNA连接酶，20℃孵育12h保证接头充分连接，然后置于-20℃下保存；接头混合物的序列如下：

Eadaptor1：CTC GTA GAC TGC GTA CC；

Eadaptor2：AAT TGG TAC GCA GTC TAC；

Madaptor1：GAC GAT GAG TCC TGA G；

Madaptor2：TAC TCA GGA CTC AT；

(2c)进行PCR预扩增：将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；预扩增PCR的反应条件为：94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min，4℃保存备用；预扩增引物的序列如下：

EcoRI-pre：GACTGCGTACCAATTCC；

MseI-pre：GATGAGTCCTGAGTAAG；

(2d)进行PCR选择性扩增：将预扩增产物稀释30倍，作为选择性扩增的模板；用含酶切位点MseI的引物和含酶切位点EcoRI的引物进行扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；PCR反应分为三步：第一步进行1个循环：94℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸1min；第二步进行12个循环：94℃变性40s，65-56℃退火40s，72℃延伸1min；第三步进行25个循环：94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min；扩增产物加入适量的上样液，94℃变性5min，立即置于冰上；

总共用了9对引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；

(2e)电泳分析：将变性好的扩增产物用6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件：电压1200V，功率50W，电流50mA，时间1.5h；总共用了9个引物组合对4个葎草雌性个体和4个葎草雄性个体的基因组DNA进行了AFLP分析，然后对电泳后产物的DNA条带图谱进行观察、照相和分析，筛选出特异片段的引物组合1个，这个引物组合产生1条雄性特异的AFLP标记；

(3)雄性特异AFLP分子标记的筛选：总共用64对引物组合对4个葎草雌性个体和4个葎草雄性个体的基因组DNA进行了AFLP分析；其中引物组合(E-CTT/M-GAC)扩增出1条雄性特异的AFLP标记；引物组合(E-CTT/M-GAC)的序列如下：

E-CTT：GACTGCGTACCAATTCCTT；

M-GAC：GATGAGTCCTGAGTAAGAC。