[发明专利]一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

葎草(Humulus scandens L)又名拉拉秧、拉拉藤，为大麻科(Cannabaceae)大麻亚科(Cannaboideae)葎草属植物，是我国广泛分布的一年生杂草。葎草花单性，雌雄异株，且性别表现稳定，花期7-8月，果期8-9月。葎草为非临床常用中草药。全草可药用，尤其是其种子中含葎草酮及蛇麻酮等，具有清热解毒、利尿、消肿、抗菌消炎、健胃抑菌、抑制病毒等功能，起到提高动物免疫力、防治疾病、促进生长的作用。另外，葎草种子对结核杆菌有显著抑制作用，对金黄色葡萄球菌也有抑制作用。所以，葎草雌株相对于雄株来讲，具有更大的药用价值。另一方面，葎草在我国分布广泛，其雄株所产生的花粉是我国夏秋季引起花粉过敏症的主要致敏原之一。因此，对其性别进行控制，培育单性群体，可以有效提高单位面积葎草的药用价值，并可避免引起花粉过敏症，有益人类的健康。然而，在发育早期，根本无法通过外观形态来鉴定葎草的性别，因此从分子水平找到一种DNA标记来鉴别发育早期的葎草植株成为葎草成功选育的先决条件，具有重要的应用价值。

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技术是可以快速有效的寻找分子标记的一种重要的方法。但考虑到应用其鉴别性别费时费力，常常将其转化为更为简便和实用的序列特异扩增区域(Sequence Characterized Amplified Regions，SCAR)标记。AFLP-SCAR标记技术用于某些植物的基因组中寻找性别标记已有成功报道。如在雌雄异株植物构树基因组中找到了一个雄性特异的分子标记，可以作为识别雌雄的探针。Stehlik等在叶蓼(Rume xnivalis L.)中获得一个长度为164bp的雄性特异性AFLP片段，并将其成功转化为SCAR标记，此标记是位于Y染色体上的串联重复的非编码DNA序列，可以鉴别叶蓼的性别。但目前国内外尚无有关AFLP-SCAR分子标记鉴别葎草性别方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法，以便利用AFLP技术对具有重要药用价值的葎草进行雌雄性别间分子差异分析，并将获得的AFLP标记转化为操作更为简便的SCAR标记。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种快速鉴别葎草性别的分子生物学方法，包括葎草雄性特异性引物序列，其特异性引物序列为上游(SCARF)：5’-TTGAAGAAATCTCATCCTCAAAGA-3’；下游(SCARR)：5’-GACCTTGGCCACAGGAATAG-3’。该方法的具体实施过程是，利用设计的特异引物序列，以葎草个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，反应组成为1U的Taq DNA聚合酶，2μL的dNTP，100-200ng的基因组DNA，其中含雄性特异上下游引物各0.1μmol/L，在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增：95℃预变性5min后，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30个循环，最后72℃延伸7min，扩增产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，DL2000marker作分子量标记，出现大小为153bp目的带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。

本发明中，利用AFLP技术对具有重要药用价值的葎草进行雌雄性别间分子差异分析，并将获得的AFLP标记转化为操作更为简便的SCAR标记。

本发明的有益效果在于：本发明中所述的SCAR引物用于预测葎草的性别，为鉴定葎草性别提供简便稳定的分子标记，在生产方面和人类健康方面具有重要应用价值。

附图说明

图1是本发明中引物组合E-CTT/M-GAC产生的葎草雄性特异AFLP条带(箭头所示)。

图2是本发明中SCAR引物SCARF和SCARR在雌性全体和雄性个体基因组中的PCR扩增结果。

图中标记说明：在图1中，1-4为雌性个体，5-8为雄性个体；在图2中，箭头所示为雄性特异的153bp条带，其中1-8为雌性个体，9-16为雄性个体，M为DL2000marker。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。

实施例1：葎草性别特异AFLP分子标记的筛选

具体包括以下几个步骤：