[发明专利]一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法

权利要求书

1.一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1）提取生物基因组DNA，并对其进行生物素标记；

2）根据生物已知SNP位点的侧翼序列，设计引物LSP1和LSP2，分别混合后得到引物LSP1混合物和引物LSP2混合物，并将引物LSP2混合物进行5’磷酸化；

3）将所述引物LSP1混合物和引物LSP2混合物与生物基因组DNA杂交，并进行磁珠吸附获得杂交吸附产物；

4）所述杂交吸附产物进行延伸连接反应获得目的DNA片段；

5） 第一轮PCR扩增及目的DNA片段扩增，PCR扩增引物为测序平台通用配对引物5SLD和3SLD，或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2；

6）对目的DNA片段进行Barcode特异性引物二轮PCR扩增，PCR扩增引物为Multi-P1和Barcode-P2，或Slx-2ND-MpPrimer和Slx-index-Barcode；

7）高通量测序；

8）测序数据分析得到SNP位点分型信息。

2.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步骤(2)中引物LSP1包括3’端的位点特异性引物SP1和5’端的5SLD两部分， 3’端的引物SP1为与SNP位点邻近的22个碱基互补的序列，5’端为通用引物5SLD 5'-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'；

引物LSP2包括5’端的位点特异性引物SP2和3’端的3SLD-RC两部分， 5’端的引物SP2为与SNP位点另一侧第4个碱基后的22个碱基互补的序列，3’端为通用引物3SLD 的反向互补序列5'- TTCGCCTTGGCCGTACAGCAG-3'。

3.根据权利要求2所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步骤(2) 中位点特异性引物SP1和SP2设计原则如下： 1)、SP1和SP2所在的位置不能含有其他SNP位点或插入缺失；2)、SP1和SP2所在的位置序列不能出现5个以上连续的相同碱基；3)、SP1和SP2的Tm值在55-65℃之间； 4)、SP1和SP2的长度定为20-24nt。

4.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步骤(3)中所述杂交及磁珠吸附方法如下：位点特异性引物与基因组DNA杂交反应总体积为50uL，包含1×杂交液，250nM LSP1 引物混合物，250nM 5’磷酸化的LSP2 引物混合物，200ng生物素标记的基因组DNA，经平衡后悬浮于10ul Wash/Binding Buffer的磁珠；

杂交反应条件为：70℃ 12分钟，以后每个循环减2℃；69℃ 12分钟，以后每个循环减2℃，进行20个循环后，保持30℃，整个杂交反应进行至少16小时。

5.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步骤(4) 中延伸连接反应的体系为50uL，包含经洗涤得到的杂交吸附产物，1U DNA 聚合酶，80U DNA 连接酶，1×HF Buffer，1mM NAD， 5mM dNTPs；45℃反应15分钟。

6.根据权利要求1所述的基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，其特征在于所述步骤(5)中所述PCR扩增引物序列如下：

5SLD：5'CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'

3SLD: 5'CTGCTGTACGGCCAAGGCGAA3'

Slx-1ST-MpPrimer-1: 5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 3'；

Slx-1ST-MpPrimer-2: 5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT 3'。