[发明专利]一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA遗传标记技术领域，具体涉及一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)主要指在基因组水平上，由于单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。SNP具有分布广泛、数量巨大，信息丰富，易于检测等优点，已成为继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记。目前SNP被广泛用于遗传图谱的构建、群体遗传学和亲缘关系、关联分析和基因功能分析等领域。

目前对于已知SNP位点的分型，根据不同研究需要和实验条件，已建立了众多检测方法，主要的分析原理包括限制性内切酶酶切技术、等位基因特异性寡核苷酸（allele specific oligonucleotid,ASO）杂交、等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE）、单碱基延伸(single base extension,SBE)、寡核苷酸连接反应(oligonucleotid ligation assay,OLA)等。主要的信号检测方法有基于凝胶电泳的检测、基于微阵列技术的检测、飞行质谱检测和直接测序法等。其中以基于微阵列技术的分型方法通量最高,目前已有多种商业化的SNP分型技术。例如ABI公司利用OLA与微阵列技术结合建立了SNPlex Genotyping System；Affymetrix公司利用ASO与高密度DNA微阵列技术相结合也开发了SNP分型平台；Illumina公司开发的GoldenGate Genotyping Assay,一次实验可对96个样本的1536个SNP位点分型。而随着全基因组扩增技术的发展和超高密度磁珠微阵列的出现，1次对几万甚至几十万个SNP分型也成为可能。

然而目前这些基于微阵列技术的高通量SNP分型方法在基因组信息丰富、芯片平台相对完善的人类和模式生物中应用较多。对于遗传信息相对匮乏的非模式生物，尤其是那些基因组较大，杂合性较高的物种，其芯片造价昂贵；且一次定制的芯片仅对固定位点分型，位点选择灵活性不高；一张芯片只用于一个个体使用，对样本量较大的群体分析和关联分析仍存在较大挑战。因而亟需一种灵活方便、成本低廉、高通量的SNP分型技术解决现有技术的局限性。

随着新一代测序技术通量不断提高和成本持续下降，借助测序技术实现生物高通量SNP分型成为可能。借助已知基因组信息的重测序、以简化基因组测序为基础的RAD、2bRAD等高通量技术目前已成功用于全基因组SNP的开发。然而对于已知SNP位点的定点分型，现有测序分型的方法并没有充分发挥高通量测序的优势，仍属于中低通量分型方法，无法实现同时对多位点、多样本的高通量分型。

发明内容

本发明的目的在于开发一种新型生物高通量、高准确性、高灵活性、低成本、方便快捷的SNP分型方法，以弥补现有技术的上述不足。

为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种基于液相分子杂交原理的高通量低成本SNP分型方法，所述方法包括以下步骤：

1）提取生物基因组DNA，并对其进行生物素标记；

2）根据生物已知SNP位点的侧翼序列，设计引物LSP1和LSP2，分别混合后得到引物LSP1混合物和引物LSP2混合物，并将引物LSP2混合物进行5’磷酸化；

3）将所述引物LSP1混合物和引物LSP2混合物与生物基因组DNA杂交，并进行磁珠吸附获得杂交吸附产物；

4）所述杂交吸附产物进行延伸连接反应获得目的DNA片段；

5）第一轮PCR扩增及目的DNA片段扩增，PCR扩增引物为测序平台通用配对引物5SLD和3SLD，或Slx-1ST-MpPrimer-1和Slx-1ST-MpPrimer-2；

6）对目的DNA片段进行Barcode特异性引物二轮PCR扩增，PCR扩增引物为Multi-P1和Barcode-P2，或Slx-2ND-MpPrimer和Slx-index-Barcode；

7）高通量测序；

8）测序数据分析得到SNP位点分型信息。

对技术方案的进一步改进：所述步骤(2)中引物LSP1包括3’端的位点特异性引物SP1和5’端的5SLD两部分，3’端的引物SP1为与SNP位点邻近的22个碱基互补的序列，5’端为通用引物5SLD5'-CTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'；