[发明专利]对虾精子成活率和质量的评价方法

权利要求书

1.一种对虾精子成活率和质量的评价方法，该方法步骤包括挑选成熟度好的雄虾的精荚放入装有灭菌天然海水的离心管中，利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的化学处理后精子悬液，其特征在于，该方法还包括以下步骤：

步骤1）生物染色及精子成活率计算：

使用灭菌天然海水分别配制4~6g/L伊红生物染色液和90~100g/L的苯胺黑的生物染色液，然后等体积混合得到混合染色液，将混合染色液和化学处理后精子悬液按照体积比例为1~2ul：8~9ul混匀并置于载玻片上，于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率；

步骤2）单细胞凝胶电泳：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取化学处理后精子悬液50~100ul，用磷酸缓冲液PBS离心洗涤后稀释游离精子至4~6×10⁶个/mL，取50~100μl稀释精液与350μL 1%的液态琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，加入细胞裂解液裂解1~2h，离心弃细胞裂解液，加入0.5~1.5mL细胞消化液，52~55℃度下水浴2~4h得到含有精子的凝胶；

b、铺片：磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后水浴加热得到含有精子的液态凝胶液，取100μL液态凝胶液加在的载玻片上制备双层凝胶；

c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中进行DNA双链解旋，在电压15~17V、电流100~130mA条件下电泳40~60min后停止电泳；

d、中和、染色：用Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品；

e、观察记录：将步骤d得到的样品加盖盖玻片置于荧光显微镜下，汞灯激发波长为510-560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照50~100个细胞；

步骤3）精子质量评价：

步骤e拍照所得彗星图像用CASP分析软件分析测量DNA迁移的参数：彗星拖尾长度、彗星尾部DNA的相对含量；彗星拖尾长度＞3像素的细胞为彗星细胞，彗星尾部DNA的相对含量＜5%的为0级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量5%～20%的为Ⅰ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量20%～40%为Ⅱ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量40%～95%的为Ⅲ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量＞95%的为Ⅳ级损伤的细胞；

根据所测参数数据计算彗星率与损伤系数进行精子质量评价，计算公式：彗星率=（彗星细胞数目/拍照细胞总数目）×100%；损伤系数=[（0级损伤的细胞个数×0）+（Ⅰ级损伤的细胞个数×1）+（Ⅱ级损伤的细胞个数×2）+(Ⅲ级损伤的细胞个数×3)+( Ⅳ级损伤的细胞个数×4)]。

2.根据权利要求1所述的对虾精子质量评价方法，其特征在于：所述的细胞裂解液含有2.5mol/LNaCl、100mmol/LNa₂EDTA、10mmol/L Tris、10g/L肌氨酸钠，pH10，临用前加1%Triton X-100和10% DMSO。

3.根据权利要求1或2任一项所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的细胞消化液含有2.5mol/L NaCl、5mmol/Ltris、0.05%肌氨酸钠，pH7.4，临用前加入蛋白酶K，终浓度0.5mg/mL。

4.根据权利要求3所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的制备双层凝胶为：吸取100μL1%正常熔点的液态琼脂糖凝胶加在普通的载玻片上，盖上22㎜×22㎜盖玻片，4℃下放置10min，待第一层胶凝固后轻轻去除盖玻片，吸取100μL含有精子的液态凝胶液滴在第一层凝胶上，加盖玻片于4℃下冷凝10min得到双层凝胶。

5.根据权利要求4所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的碱性电泳液含有300mmol/L乙酸钠、100mmol/LTris，pH10。

6.根据权利要求4或5任一项所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的GelRed稀释液为用双蒸水将GelRed10000×储液稀释3300倍到0.1mol/L NaCl中。