[发明专利]对虾精子成活率和质量的评价方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物细胞活力分析技术领域，涉及一种基于生物染色和核酸染色对虾精子成活率和质量的评价方法。

背景技术

对虾属于节肢动物门、有鳃亚门、甲壳纲、软甲亚纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属。凡纳滨对虾是甲壳纲对虾属的主要种类之一。凡纳滨对虾的精子不具有鞭毛，不能运动，由于其所具有的的特征，使对其质量和活力的评价成为一个难题，为此许多研究者正积极完善和发展可靠的甲壳动物精子质量和成活率的评价方法。这些方法包括：精子数目及形态、生物染色、低渗外吐、精卵相互作用、生化分析、精子顶体反应、核酸染色等。

目前，精子生物染色最常用的是台盼蓝染料排斥实验。正常的精子能排斥染料，不被台盼蓝染色；质量差、活力弱或细胞膜完整性被破坏后，台盼蓝会弥散到细胞中。除台盼蓝以外，还有其它的染料，如曙红和苯胺黑等。近年来，染色法已被用于评价甲壳动物精子活力，柯夫亚等（1996）采用台盼蓝和曙红B染料对冷冻保存的中国对虾精子进行评价。Jeyalectunmie（1989）采用曙红和苯胺黑染色对青蟹精荚中精子活力进行了评价，精荚中的死精子细胞呈现粉红色，而活力精子细胞在苯胺黑的红色背景下不着色。Wang等（1995）比较了精子形状、台盼蓝染色、亚丁醇染色及卵水诱导顶体反应这四种技术，未能得到确定的结论，却发现精子形态和亚丁醇染色之间具有很好的相关性。有时将台盼蓝和吉姆萨联合使用，可同时达到区分精子死活、鉴别精子顶体反应的目的。

总的来说，染色相斥实验是一种粗略的估计精子成活率的方法，无法区分10%～20%的存活率差异，此外排斥实验后的精子存活力将受到影响。生物染色和形态评价对精子活力的生理和生化功能提供的信息有限，生物染色可能过高估计了活精子的比例，这可能与精荚、精子膜的通透能力及不同色素的通透能力之间存在着差异有关。

发明内容

本发明的目的：为克服现有对虾精子质量和成活率评价方法中存在误差大、评价效果差、评价信息有限等缺点，提供一种基于生物染色和核酸染色对对虾精子成活率和质量的评价方法。该方法采用比较合适的混合生物染色液，背景色对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，结果快速准确、特异，而且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子的损伤比率，可区分10%~20%的存活率差异，获得更多信息。

本发明的技术方案如下：一种对虾精子成活率和质量的评价方法，该方法步骤包括挑选精荚成熟度好的雄虾精荚放入装有灭菌天然海水的离心管中，利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液。具体操作为：采用1g/L胰蛋白酶消化获得游离的精子，5mL离心管中加入3mL胰蛋白酶溶液和3个精荚，37℃水浴消化5min后，加入1mL15% (V/V)的胎牛血清终止消化反应，500r/min离心10min，收集上清平均分配于3个1.5mL的离心管中，2000r/min离心5min，吸弃上清，每管中加入1mL灭菌天然海水轻轻吹打均匀，获得游离的对虾精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的对虾精子。

该方法还包括以下步骤：

步骤1）生物染色及精子成活率计算：

使用灭菌天然海水分别配制4~6g/L伊红生物染色液和90~100g/L的苯胺黑的生物染色液，并通过定量滤纸过滤后置于棕色瓶中备用，使用前将伊红生物染色液和苯胺黑的生物染色液等体积混合得到混合染色液，按照混合染色液：精子悬液体积比例为1~2ul：8~9ul分别取混合染色液和化学处理后精子悬液置于载玻片上混匀，然后在载玻片上盖上盖玻片，室温静置1~5min后，置于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率。

步骤2）单细胞凝胶电泳：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取化学处理后精子悬液50~100ul，用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS离心洗涤精子悬液2~3次，再用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS稀释游离精子至4~6×10⁶个/mL，取50~100μl稀释精液与350μL 1%的液态低熔点琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，4℃放置5~10min，加入0.5~1.5mL细胞裂解液在4℃裂解1~2h，吸弃细胞裂解液，加入0.5~1.5mL细胞消化液，52~55℃度下水浴2~4h得到含有精子的凝胶。

b、铺片：pH=7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后在70℃水浴加热3~5min，使含有精子的低熔点琼脂糖融化成液态得到含有精子的液态凝胶液，取100μL含有精子的液态凝胶液加在载玻片上制备双层凝胶。