[发明专利]一种来源于里氏木霉的新(R)-转氨酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物催化领域，主要涉及一种来源于里氏木霉的新(R)-转氨酶及其在生产手性胺和非天然氨基酸方面的应用。

背景技术

手性胺和非天然氨基酸在医药、食品、化妆品等高附加值领域具有广泛的应用。例如(R)-4-苯丁基-2-胺(抗高血压药Dilevalol的前体)、苯基异丝氨酸(β-氨基酸，抗癌药紫杉醇的侧链部分)和Cispentacin(环状β-氨基酸，抗真菌药物)等皆为药物合成的关键中间体或者关键手性模块，D-丙氨酸等非天然氨基酸越来越多被用于高级化妆品。另外，研究表明，含有非天然氨基酸的多肽应对蛋白酶降解的稳定性高于天然多肽，并且仍然保持其生物活性。这显示在研发高稳定性且不被人体排斥的新药、抗体以及人造蛋白质方面，非天然氨基酸或将发挥不可替代的作用。然而，与天然氨基酸不同，手性胺和非天然氨基酸尚不能通过发酵法进行工业化生产，现在主要依靠有机合成法进行生产。有机合成法的不足是不易得到光学纯的产物，而且通常需要高压高温高能耗，因此亟需实现手性胺和非天然氨基酸的绿色生产。

转氨酶，又叫氨基转移酶，是催化氨基化合物和羰基化合物之间氨基可逆转移(乒乓机制)的一类酶，根据其底物氨基的位置，可以分成α-转氨酶和ω-转氨酶。α-转氨酶较为常见，只能催化α-氨基的转移；而ω-转氨酶则较为罕见，除了能催化α-氨基的转移，也能催化非α位氨基的转移，具有更为宽广的底物谱和严格的立体选择性，能够在温和条件下拆分胺消旋体(附图1a)或者催化前手性底物羰基上的不对称加氨(附图1b)来生产手性胺及非天然氨基酸。另外，ω-转氨酶以磷酸吡哆醛(PLP)为辅基，催化反应过程中无需添加额外的辅因子循环，这在工业应用中很有优势。总之，用ω-转氨酶来生产光学纯的手性胺和非天然氨基酸，可以避免传统化学法的高压高温高能耗高污染，是符合绿色生产理念的先进生物制造，显示出替代有机合成法的巨大潜力。例如，2010年Science报道了Codexis公司与Merck公司的研究成果，采用(R)选择性的ω-转氨酶成功替代了基于贵金属铑催化的化学法来工业化生产抗糖尿病药物西他列汀(一种手性胺)。

严格的立体选择性是酶区别于化学催化剂的关键特性，所以获得特定立体选择性的酶，是后续研究改造和工业应用的重要基础。根据文献报道，ω-转氨酶中(S)选择性的酶较为常见，而(R)选择性的ω-转氨酶(下文称为(R)-转氨酶)却较为稀有([1]Koszelewski D，Tauber K，Faber K，et al.ω-Transaminases for the synthesis of non-racemicα-chiral primary amines[J].Trends in biotechnology，2010，28(6)：324-332.[2]Mathew S，Yun H.ω-Transaminases for the production of optically pure amines and unnatural amino acids[J].Acs Catalysis，2012，2(6)：993-1001)。至今为止，国内尚未有(R)-转氨酶的报道。因此，发掘具有工业应用潜力的新(R)-转氨酶对手性胺和非天然氨基酸的绿色生产具有特殊的意义。

发明内容

本发明的目的是为手性胺和非天然氨基酸的绿色生产提供一种具有工业应用潜力的(R)-转氨酶。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种来源于里氏木霉Trichoderma reesei QM6a的新(R)-转氨酶(称为HTR)，其基因核苷酸序列如SEQ NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本领域研究者对新(R)-转氨酶HTR进行蛋白质工程改造(例如氨基酸残基保守置换、氨基酸序列增长截短、合理设计、定向进化、酶的化学修饰等)所获得的(R)-转氨酶，也属于本发明的范围。

本发明的另一目的是提供一种制备新(R)-转氨酶HTR的方法。