[发明专利]一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法及应用

权利要求书

1.一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法，其特征在于，步骤如下：

1）将双精氨酸信号肽基因和胆盐水解酶基因融合；

2）将融合基因连接到大肠杆菌表达载体；

3）步骤2）得到重组载体转化大肠杆菌宿主得到重组菌；

4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双精氨酸信号肽为torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽中任一一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）表达载体为pET-20b(+)或pET-22b(+)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主为E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1）将双精氨酸torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽任一一种和胆盐水解酶基因融合；

2）融合基因连接到大肠杆菌表达载体pET-20b(+)或pET-22b(+)；

3）步骤2）得到重组载体转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种得到重组菌；

4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）合成含有双精氨酸信号肽序列的质粒pUC57-Tat；

2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh，torA，dmsA和fdnG基因，并将bsh基因分别与torA，dmsA和fdnG基因进行融合；

3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)和pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；

4）将测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)和E.coli Rosetta-gami(DE3)，得到重组菌；

5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）合成含有双精氨酸torA信号肽序列的质粒pUC57-Tat;

2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和torA基因，并将bsh基因与torA基因进行融合；

3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；

4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌；

5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）合成含有双精氨酸dmsA信号肽序列的质粒pUC57-Tat;

2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和dmsA基因，并将bsh基因与dmsA基因进行融合；

3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-20b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；

4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌；

5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）合成含有双精氨酸fdnG信号肽序列的质粒pUC57-Tat;

2）设计引物分别以L.plantarum BBE7的基因组DNA，pUC57-Tat为模板扩增bsh和fdnG基因，并将bsh基因与fdnG基因进行融合；

3）将融合得到的基因片段进行双酶切，并分别与经过相应酶切的质粒pET-22b(+)进行连接，转化E.coli JM109感受态细胞，并挑选阳性克隆进行测序；

4）将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS，得到重组菌；

5）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。