[发明专利]一种利用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用双精氨酸信号肽促进胆盐水解酶基因表达的方法和应用，属于基因工程技术领域。 

背景技术

胆盐水解酶（BSH）是乳酸菌的一种代谢产物。BSH除具有水解结合态胆盐外，还可提高菌体存活率、促进菌体自身营养价值、改变菌体细胞膜的特性以及脱除胆汁对菌体的毒害作用；对于宿主，BSH可降低血清胆固醇、消弱机体对脂肪的消化吸收。目前已经检测到的BSH酶活性的菌有乳杆菌，双歧杆菌，肠球菌，梭状芽孢杆菌，类杆菌和链球菌等。然而，国内利用大肠杆菌产胆盐水解酶的专利和文章报道很少。 

由于用pET-28a(+)对BSH在大肠杆菌的胞内进行表达时，酶活不是很高，给后续BSH的分离纯化带来了巨大挑战。此外，利用大肠杆菌自身的信号肽PelB将BSH进行分泌表达时，在胞内和胞外都没有得到目的蛋白，也没有检测到BSH活性。因此，如何提高BSH的表达量已经成为当前亟需解决的关键问题。 

在细菌中，大量新合成的蛋白都是通过转运被分泌到周质空间或培养基中。而且大多数蛋白都是以未折叠的形式通过Sec系统（secretory system）被转运的。对于通过这一系统进行转运的蛋白适的伴侣蛋白造成的。此外，一些异源蛋白分泌以后会被胞外的蛋白酶降解来说，在细胞壁内的翻译后折叠通常不能有效地进行，这可能是由于细胞壁环境中缺乏合，这也会极大地降低了发酵上清液中目的蛋白的表达量。 

然而，有一类蛋白是通过双精氨酸转运系统（twin-arginine translocation(Tat)pathway）进行转运的。这个系统转运的蛋白都是完全折叠好的或寡聚的蛋白，特别是那些在细胞质以外的环境中不能正确折叠的异源蛋白。在这个系统中，蛋白质都是通过镶嵌在细胞膜上的带有N端信号肽的Tat移位酶（Tat translocase）进行转运的，由于这些信号肽含有保守的（S/T）RRXFLK序列，所以也被称为双精氨酸信号肽（twin-arginine signal peptides）。 

这些信号肽的疏水区的疏水性比Sec途径信号肽相应区域的疏水性要弱，而且它们的c端带有正电荷，而Sec途径的信号肽的c端为中性。蛋白的跨膜转运都是通过双精氨酸信号肽与Tat转运系统的相互作用完成的，在大肠杆菌中，这个转运系统是由膜蛋白TatABC组成的。这三个亚基会形成两个大分子的复合体，包括具有转运蛋白能力的转运通道复合体TatA和能够特异性识别转运蛋白的双精氨酸序列的信号识别复合体TatBC。 

在细菌中，Tat途径已经被成功用于分泌多种蛋白，包括周质配基结合蛋白，毒性因子， 氧化还原酶以及不能用Sec系统转运的绿色荧光蛋白等。与Sec途径只转运未折叠的蛋白不同的是，只有获得正确的折叠构象或含有辅因子的蛋白才能通过Tat途径进行转运。此外，许多不含辅因子的水解酶也是通过大肠杆菌或其它微生物的Tat途径进行转运的。 

本发明利用三种双精氨酸信号肽和四种E.coli宿主对L.plantarum BBE7BSH在E.coli中进行了分泌表达。为BSH的分离纯化和酶学性质研究奠定了基础，也为其它异源蛋白的分泌表达提供了有效的方法。 

发明内容

本发明提供了一种用双精氨酸信号肽发酵生产胆盐水解酶的方法，技术方案如下： 

1）将双精氨酸信号肽基因和胆盐水解酶基因融合； 

2）将融合基因连接到大肠杆菌表达载体； 

3）步骤2）得到重组载体转化大肠杆菌宿主得到重组菌； 

4）利用重组菌发酵生产胆盐水解酶。 

其中，双精氨酸信号肽为torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽中任一一种。表达载体为pET-20b(+)或pET-22b(+)。大肠杆菌宿主为E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种。 

步骤如下： 

1）将双精氨酸torA信号肽，dmsA信号肽或fdnG信号肽任一一种和胆盐水解酶基因融合； 

2）融合基因连接到大肠杆菌表达载体pET-20b(+)或pET-22b(+)； 

3）步骤2）得到重组载体转化E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)pLysS，E.coli Rosetta(DE3)或E.coli Rosetta-gami(DE3)中任一一种得到重组菌；