[发明专利]一种鲤春病毒标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于检测用病毒培养物标准品及其制备方法技术领域，具体涉及鲤春病毒标准样品及其制备方法。

背景技术

我国是世界上最大的水产品生产和输出国，目前，我国水产品总量已占全球渔业总产量的40%，连续15年居世界首位，养殖水产品产量占世界养殖总产量的70%。水产品在保障国家粮食安全、促进农民增收和农村经济稳步发展中发挥了重要作用。我国水海产品出口面临的壁垒主要为绿色壁垒，如日本的“肯定列表制度”、欧盟的《欧盟食品及饲料安全管理法规》及有关法令、美国的《最严谨的水产养殖规范》（BAP）等，欧盟启动了对我国进口人工养殖海产品的审查；韩国政府也禁止我国34家水产养殖企业向韩国出口鱼类等水产品，严重制约了我国水产品的出口增长。

鲤春病毒病(又称鲤鱼传染性腹水症)是由鲤春病病毒（SVC）感染而引起鲤鱼科的一种急性、出血性传染性病，是对水产养殖业危害较大的一种传染性疫病。也是我国动物防疫法规定的一类动物疫病，OIE将其列为需要向OIE申报的疫病。该病原广泛存在，传播速度快，潜伏期短，死亡率高，可导致整个鱼塘毁灭性打击，且该病毒传播快且比较难控制疫情，是水生动物检疫中严格检验控制的病毒。鲤春病毒血症的流行地域广，流行于欧洲、中东和俄罗斯，主要有奥地利、匈牙利、保加利亚、法国、德国、英国、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克、俄罗斯等，近几年逐步蔓延到美洲和亚洲。该病是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象，可引起各国的贸易摩擦和巨大的经济损失。1998年英国从北京进口一批观赏鱼中检出含有鲤春病病毒，并以此要求中国对所有出口观赏鱼饲养场进行两年以上的净化及SVC监测，直至保证没有SVC，方可向英国出口。随后，中国观赏鱼出口的传统市场法国、意大利、西班牙、比利时、日本和新加坡等也相继提出了类似要求。后经英国有关专家证实，北京并未发现任何SVC感染情况。但是，我国却为此损失创汇1亿多元，而且全国的观赏鱼产业从此一落千丈。2002年美国北卡罗来纳州发生该病导致15万尾锦鲤的损失，同年6月美国威斯康星州的野生鲤鱼也大量发病。2003、2005、2007年英国在本地均检出SVCV。中国养殖鲤鱼占淡水鱼21%，养殖历史悠久，但未见该病暴发的正式报道，该病一旦发病，将给我国养殖渔业以沉重的打击。

由于养殖生态环境恶化，疾病预防意识差，滥用药物普遍，水生动物种苗质量不高，防疫体系不健全等原因导致水生动物发病。系统内送检鱼的样品通常眼观来看都比较健康，而鲤春病毒通常只有在适宜的温度下才能发病，而且现在用的PCR方法只能从重度感染表现出临床症状的鱼中检出病毒，无法检测潜在的病毒。随着进出口贸易的增大，检验流程时限要求缩减，鱼类疫病多数要上细胞进行先增殖，而普通的水生动物疫病实验室很难得到该病毒，对实验室的质量控制及研究带来了极大的挑战。

发明内容

为解决上述技术问题，帮助实验室建立好的质量保证，辽宁出入境检验检疫局从2006年就开始从事水生动物疫病及标准样品的研究工作，成立了研制标准样品工作小组，由辽宁出入境检验检疫局制备测试样品，使用的鲤春病毒株SVCV-DL来源于日常搜集样品。进行了原材料的选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等项工作。

本标准样品的研制成功，不仅为检测研究、医药研究、应用研究提供了标准样品的需求，同时为检验检疫机构技术指导、服务出口企业提供技术上的支持。

本发明的一方面在于：公开一种鲤春病毒标准样品的制备方法，其包括以下操作步骤：

a.病毒的增殖

选长满单层的EPC细胞，倒掉培养液，接种SVC病毒液；于15℃吸附2小时；补加M199维持液，继续培养至细胞病变达到80%以上，收获病毒培养物，于-20℃保存备用；

b.冻干工艺

冻干保护剂为：按以下组分和重量体积比配制而成：海藻糖：去离子水为5%，脯氨酸：去离子水为5%，脱脂奶粉：去离子水为10%；

冻干工艺为：取步骤a中病毒培养物与冻干保护剂按等体积比均匀混合，于-30℃中预冻24h后，移至冻干机中，保持真空度在30～40mtorr间，真空干燥24h，即为鲤春病毒标准样品。

对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤a所述收获病毒培养物为：待EPC细胞感染SVC病毒后脱落，出现细胞病变后反复冻融细胞培养物三次，于4℃，10000r/min离心10min制备获得。

对于上述技术方案中，所述的鲤春病毒标准样品的制备方法，其步骤b所述冻干保护剂经过108℃,15min灭菌。