[发明专利]一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术，具体的说涉及一种新型内酰胺类抗生素合成酶及其编码基因和应用。 

背景技术

β-内酰胺类抗生素主要包括青霉素类和头孢菌素等类抗生素，是目前国内外主要使用的抗生素。该类抗生素在医药产业中占有重要的份额，约占全球抗生素年销售额的65％以上。2012年5月，中国市场调查网对医院头孢类抗菌素用量预测：中国目前医药市场容量约为1200亿元人民币，其中头孢菌素类抗生素约为130亿元左右。国外头孢菌素类抗生素药费占抗感染药费总额的40％（薛雨等，中国抗生素杂志，36(2)：86-92，2011．）。 

国内抗生素制药企业在高端品种和前沿技术方面的创新能力与发达国家相比存在较大差距，特别是酶法氨苄西林、阿莫西林、头孢菌素等需要加快技术创新产业化。目前采用的化学合成法生产成本高，反应条件苛刻，低温反应，能耗大，使用大量的有机溶剂，污染严重。与之相比，酶法能在更为温和的条件下酶促合成半合成青霉素、头孢菌素，在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，被称为绿色工艺，并且经过多年的研究，采用酶法合成阿莫西林、头孢氨苄等品种的工艺已经成熟，产品收率达到或超过了传统的化学合成法，随着各国对环保问题的重视，要求的提高，酶法技术替代化学法制备抗生素已经势在必行。 

酶法合成内酰胺类抗生素目前应用主要为青霉素酰化酶（E.C.3.5.1.11），又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。应用最广的为青霉素G酰化酶，即PGA，主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得，该酶已大规模应用于工业生产β-内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β-内酰胺类抗生素（Chandel,A.K.et al.Enzyme and Microbial technology,42,199-207，72008）。 

青霉素酰化酶最早是利用其催化水解反应得到中间体6-APA和7-ACA，而该反应为可逆反应，所以可以利用该特性进行半合成青霉素和头孢菌素,具体的是利用青霉素酰化酶催化酰基侧链和β-内酰胺核的缩合反应。 

酶法合成β-内酰胺类抗生素的产量取决于三方面：：(1)β-内酰胺类化合物的合成反应；(2)活化的酰基供体（侧链）的水解反应；(3)合成的抗生素（产物）的水解反应。这三方面的反应决定了最终的反应收率和产率。β-内酰胺类抗生素的水解反应和合成反应的相对速率，一方面可以通过合成反应条件的调整进行调节，另一方面可以通过改进合成用酶从而 实现有利合成反应的方面。 

Alkema等将E．coli PGA进行突变，结果E.coli PGA的β亚基24位上的苯基丙氨酸突变为丙胺酸，该酶在合成氨苄青霉素及头孢菌素的过程中，表现出较高的合成／水解相对速率。但该酶的酶活活性较低，不具有工业化的效果（Alkema W B L,et al.Eur J Biochem,269：2093-2l00,2002）。专利CN101177688提供了一种巨大芽孢杆菌PGA的突变体，该酶可以促进合成反应但其合成活性较低，也不具备工业化潜力。专利CN102264904提供了一种大肠杆菌青霉素酰化酶突变体，该酶具有一个或者多个突变位点，该酶可以用于阿莫西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄或者头孢拉定的合成，其在阿莫西林合成中6-APA和HPGME的摩尔比最优可以达到≤1.02，而6-APA的转化率更优选的可以达到≥99%，但该酶的活性不得而知。