[发明专利]带HA标签的LAMP1真核表达载体及其在溶酶体分离中的应用

说明书

【技术领域】

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种带HA标签的LAMP1（溶酶体膜蛋白1）真核表达载体及其在溶酶体分离中的应用。

【背景技术】

溶酶体（lysosome）是真核细胞中由单层脂蛋白膜包绕的含一系列酸性水解酶的小体，是细胞内吞和细胞自噬两条代谢途径的共同终点。溶酶体既能通过与吞噬体融合，酸化水解通过内吞途径进入细胞的生物大分子物质，调节细胞水平的信号传递，又能通过与自噬体融合，降解通过自噬途径包裹到自噬体中的细胞器和内源性生物大分子，为细胞提供生物合成的新原料。通过分子生化手段分离溶酶体对于研究细胞内吞和细胞自噬两条代谢途径意义重大。传统应用于分离溶酶体的方法主要是密度梯度离心。密度梯度离心法是指用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞裂解液分层、分离。该方法通过利用细胞中不同细胞器的沉降系数不同，在一定离心力作用下，细胞器会分布到密度梯度的不同区域中，最后再通过免疫印迹法鉴定出溶酶体所分布的区域，并将这一区域都作为溶酶体分离出来。

密度梯度离心法分离溶酶体耗时长，分离效率低，而且无法得到纯度较高的溶酶体。LAMP1是溶酶体表面特异性定位的膜蛋白，被广泛的用作溶酶体的标识物。LAMP1蛋白分子的大部分区域定位于溶酶体的内腔中，仅有C端一小部分跨过溶酶体膜，暴露在溶酶体表面与胞浆接触。依据LAMP1的特性，我们以LAMP1蛋白作为溶酶体的标识物，用免疫沉淀的方法分离溶酶体，会简化了纯化步骤，提高了分离得到的溶酶体的纯度。而现有的靶向细胞内源性LAMP1的抗体特异性和效价都不高，不离于高效的分离溶酶体。用传统的密度浓度梯度法分离溶酶体具有耗时长，样品需求量大，而且无法得到纯度较高的溶酶体。

【发明内容】

本发明的首要目的在于提供一种带HA标签的LAMP1真核表达载体。

本发明的另一目的在于提供所述带HA标签的LAMP1真核表达载体的构建方法。

本发明的再一目的在于提供所述的带HA标签的LAMP1真核表达载体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种带HA标签的LAMP1真核表达载体，其中所含的带HA标签的LAMP1的核苷酸序列为（如SEQ ID NO.1所示）：