[发明专利]一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法

权利要求书

1.一种检测单糖和二糖的方法，包括如下步骤：

(1)将单糖或二糖用衍生试剂衍生；

(2)用液相色谱质谱联用(LC-MS)分析衍生后的样品；

其特征在于，所述的衍生试剂包含1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)；

所述的衍生试剂PMP与D3PMP、D8PMP中任意一种联用；

所述的衍生试剂PMP与D3PMP、D5PMP、D8PMP任意两种或三种联用；

所述的衍生试剂D3PMP、D5PMP、D8PMP任意几种联用。

2.如权利要求1所述的一种检测单糖和二糖的方法，其特征在于，所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元，所述的二糖为酶解糖胺聚糖所得的二糖。

3.制备如权利要求1或2任意一项所述的衍生试剂D3PMP的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70-90℃加热回流1-5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl₂及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；

(2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6-7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；

(3)取苯肼加入乙醇中，再加入步骤(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85℃条件下反应10h，冷却过滤得D3PMP；

所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1：2-5；

所述的苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1：0.2-0.8。

4.制备如权利要求1或2任意一项所述的衍生试剂D3PMP的方法，其特征在于，所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1：2，苯肼和氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1：0.8。

5.制备如权利要求1或2任意一项所述的衍生试剂D8PMP的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取氘代乙酸，加入乙醇，氯化亚锡摇匀后，70-90℃加热回流1-5h，蒸馏出液体，生成氘代乙酸乙酯，将氘代乙酸乙酯用饱和CaCl₂及硫酸镁干燥，除去乙醇，乙酸，水，得干燥的氘代乙酸乙酯；

(2)向干燥后的氘代乙酸乙酯中加入金属钠，冷凝回流，再加入50％的醋酸，调节pH至6-7，用饱和氯化钠静置分层，转移上层液体，用无水硫酸钠进行干燥，得氘代乙酰乙酸乙酯；

(3)取30％盐酸与水，滴加氘代苯胺，在0-5℃条件下滴加71.8％亚硝酸钠溶液，搅拌并保持0-5℃反应3-5h，得重氮化氘代苯。向重氮化氘代苯中加入亚硫酸氢钠，25％氨水和水，升温至70～85℃，回流反应4h，放入4℃冰箱降温，过滤得氘代苯肼盐酸盐。向氘代苯肼盐酸盐中加入水，加热到50℃，滴加10M的氢氧化钠调节pH至10-11，搅拌30min，加入乙酸乙酯萃取3次，减压蒸馏得到氘代苯肼；

(4)将步骤(3)所得的氘代苯肼溶于乙醇中，加入步骤(2)所得的氘代乙酰乙酸乙酯，于70-85℃条件下反应10h，冷却过滤，得D8PMP；

所述的氘代乙酸和乙醇的体积比为1：2；

所述的氘代苯胺与亚硝酸钠的物质的量之比为1：1；

所述的氘代苯肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质的量之比为1：0.7。