[发明专利]一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种检测单糖和二糖的方法及衍生试剂的制备方法。

背景技术

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(简称PMP)，又以脑保护剂“依达拉奉”闻名，在临床上主要用于用于治疗脑梗塞引起的神经病变，在糖结构研究中则做为一种衍生制剂，由Honda于1989年最先用于糖链的衍生，PMP作为衍生制剂的优点是可以在温和的条件下与还原糖链进行定量反应，不损失唾液酸，产物没有立体异构体，紫外吸收强，糖链经PMP衍生后，其疏水性提高的同时，衍生产物带电荷，易于电离，可以用多种离子模式对其进行分析，用其作为衍生试剂，可以进行单糖的组成分析，检测限可以达到pmol，同时也可以用于寡糖链的分离和纯化，还可以提高糖链的基质辅助激光解析飞行质谱检测的灵敏度。其和糖类反应机理为，1，3位取代的吡唑啉酮试剂的4位碳存在α-氢，在碱性环境下离去成为烯醇式负离子，和糖类物质的还原端进行醛酮缩合反应，在加热条件下失水，形成具有α，β-不饱和酮结构的单分子衍生物，此单分子衍生物会继续与另一分子吡唑啉酮试剂的烯醇式负离子进行Michael1，4加成反应，最后定量生成具有强烈紫外吸收的双PMP衍生产物。该方法已经广泛应用于具有还原端的糖类分析，如专利CN101118230公开了用0.5mol／L PMP甲醇溶液检测虫草多糖的单糖组成。专利CN200810013642公开了用PMP衍生结合液相色谱分析样品中喹诺糖的含量。专利CN200810016622公开了用PMP衍生结合高效液相色谱检测海参制品中海参多糖的含量。

液相色谱质谱联用(LC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，液相色谱质谱联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

同位素具有相同的化学性质，离子化能力一致，在液相上的保留时间也是相同，用同位素试剂衍生未知含量和已知量的样品，可以在同一个时间内分析多个样品，使用已知量样品可以对未知样品进行准确定量，从而使质谱法成为一种可以对样品进行精确定量的方法。

糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元(氨基己糖和己糖糖醛酸)组成的线性高分子多糖，分为肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸角质素等。线性高分子糖胺聚糖用酶降解便能得到糖胺聚糖酶解二糖，如将肝素用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III等肝素酶降解，将硫酸软骨素用硫酸软骨素酶ABC降解得到相应的糖醛酸脱水二糖。不同种类的糖胺聚糖所具有的二糖重复单元不同，如肝素和硫酸乙酰肝素的重复二糖单元是艾杜糖醛酸(IdoA)或葡萄糖醛酸(GlcA)和葡萄糖胺(GlcN)；硫酸软骨素的二糖重复单元是葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)。不同种类的糖胺聚糖硫酸化程度不同，硫酸化位置亦不同，如肝素比硫酸乙酰肝素在葡萄糖胺的N硫酸化(GlcNS)程度高，而乙酰化(GlcNAc)程度低；硫酸软骨素A在半乳糖胺的4位硫酸化(GalNAc4S)，而硫酸软骨素C在半乳糖胺的6位硫酸化(GalNAc6S)。糖胺聚糖有多种生物活性，如肝素是临床首选的抗凝药物；硫酸乙酰肝素是细胞表面的信号传导的重要分子；软骨素类，透明质酸类都有相关的药物或保健品已上市。2008年，污染肝素事件造成了至少149人死亡，究其原因，是对糖胺聚糖这类结构复杂的多糖研究技术和方法上存在缺陷，所以确定糖胺聚糖的单糖和二糖是非常必要的。

目前常用的检测方法在各种各样的缺点，如用质谱法分析样品必须先进行质子化，而这一过程受外界环境，样品中盐浓度，仪器状态诸多因素影响，无法用于定量分析。PMP衍生结合高效液相色谱法虽然可以对样品进行定量分析，但需要首先绘制各单糖的标准曲线，然后再计算出待测样品的浓度，检测限高，样品消耗量大，一次只能检测一个样品，耗时长。用普通PMP衍生试剂获得的分离糖PMP衍生物受紫外检测器灵敏度和单糖本身差异较小的限制，需要标准品和较多的糖样品才能准确分析，不仅步骤繁琐，而且对于珍贵的生物样品来说也是一种浪费。普通衍生方法及试剂(如苯胺和氘代苯胺)最多能同时进行2种样品的分析，最多能对1种未知样品定量。当样品种类较多时，用传统的方法检测步骤繁琐，样品消耗量大，检测时间长，传统的方法已经不能够满足需要，因此亟需找到一种操作步骤简单，省时，样品消耗量小，灵敏度高的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测单糖和二糖的方法，该方法可对单糖和糖胺聚糖酶解二糖进行定性和定量分析。