[发明专利]一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种检测单糖的方法及衍生试剂的制备方法。

背景技术

目前，多糖领域中面临很多挑战。多糖的研究不仅仅限于对大量样品的分析，对于生物来源的样品研究也越来越多。由于生物来源(如血液、细胞、组织)的样品多糖量少，单糖极性较强，结构相近，且缺乏光学活性，采用常规方法对其分离鉴定较为困难。糖在紫外区无吸收，传统的示差折光检测法的灵敏度低且不利于梯度洗脱。为了改善其分离选择性和提高检测灵敏度，人们常采用衍生化处理，将糖类组分转变为带发色基团的分子，然后进行紫外或荧光检测。

液相色谱质谱联用(LC-MS)是一种很好的检测方法。它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品由流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱的优势互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

糖类物质的衍生反应多基于还原氨化法，不仅过程繁琐、反应时间长，而且可导致不稳定基团如唾液酸残基的解离，给测定结果带来偏差。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，常被用于衍生单糖，结合高效液相色谱法分析，具有反应条件较温和，产物无立体异构等优点。1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)也是常用的衍生试剂，如孙志伟等用NMP衍生测定油菜花粉多糖中单糖的组成(孙志伟，刘凌君，户宝军，等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生试剂的制备及其在高效液相色谱-质谱法测定糖类化合物中的应用[J].色谱,2008(02)：200-205)，其反应机理与PMP相同，都可以与单糖反应生成具有紫外吸收的糖-双衍生试剂产物，但是以上两种衍生试剂都存在检测限高，样品消耗量大，用质谱检测只能对样品定性，不能定量等缺点。用普通衍生试剂衍生结合LC-MS对单糖定量，需要做一系列的标准曲线，不仅步骤繁琐，而且对珍贵的生物样品来说也是一种浪费，同时单糖的分离结果并不理想。

发明内容

针对以上现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种定性定量检测单糖的方法。

实现上述发明目的的技术方法是：

1.一种检测单糖的方法，具体包括如下步骤：

(1)用衍生试剂对单糖进行衍生；

(2)将衍生产物进行液相色谱质谱联用(LC-MS)分析；

所述的衍生试剂包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)；

所述的衍生试剂D3NMP单独使用或与NMP联用。

2.一种检测单糖的方法，其特征在于，所述的单糖为动物、植物和微生物来源的多糖及寡糖的基本组成单元。

3.D3NMP的制备方法包括如下步骤：

(1)称取萘肼盐酸盐，置于水中，加热至100℃，使其完全溶解，用20％NaOH溶液调节PH至8-9，抽滤后得到固体，用水洗涤直至PH为7，抽滤后真空干燥，得萘肼；

(2)将萘肼加入无水乙醇中，于55℃水浴条件下搅拌至其溶解，滴加氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完毕后反应2h，然后升温至80℃回流7h，将反应液减压浓缩至原体积的1／3，用甲醇将其重结晶3次，得D3NMP；

其中萘肼与氘代乙酰乙酸乙酯的物质量之比为1.2：1。

反应方程式如下：

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明方法对微量样品既可以定性又可以定量，检测灵敏度高，操作简便，可以同时对两种未知样品进行相对定量，质谱图信噪比低，分离所需的流动相极生小，对色谱柱有很好的保护作用，大大延长了柱子的使用寿命。本发明方法比传统PMP衍生法的灵敏度高4-5倍，比传统NMP衍生法能够更好地分离单糖，不会出现单糖色谱峰重叠的现象。

附图说明

图1为七种单糖标准品D3NMP衍生产物的紫外吸收图。

图2为葡糖糖NMP衍生物及葡萄糖D3NMP衍生物的质谱图。

图3为葡糖糖醛酸NMP衍生物及葡萄糖醛酸D3NMP衍生物的质谱图。

图4为葡糖糖胺NMP衍生物及葡萄糖胺D3NMP衍生物的质谱图。

图5为未知样品1的NMP衍生物及未知样品2的D3NMP衍生物的质谱图。

图6为七种单糖标准品PMP衍生产物与D3NMP衍生产物紫外吸收对比图。

图7为标准单糖NMP衍生物的色谱分离图。