[发明专利]水仙BES-SSR标记引物 TCA5及鉴定水仙品种的方法

权利要求书

1.一种水仙BES-SSR标记引物TCA5，由上游引物TCA5F和下游引物TCA5R组成，其特征在于核苷酸序列如下：

TCA5 F: 5'-GCAGTTTCCGCAAGTTTAG-3'

TCA5 R: 5'-CACCCAGAAGACTGACGAG-3'。

2.利用如权利要求1所述的水仙BES-SSR标记引物TCA5鉴定水仙品种的方法，包括水仙基因组总DNA提取、PCR总反应体系建立、PCR扩增程序、聚丙烯酰胺凝胶电泳条件和PCR扩增产物的检测鉴定，其特征在于：

（1）水仙基因组总DNA提取：利用改良的CTAB法提取水仙基因组总DNA；

（2）PCR总反应体系建立：总反应体系20ul：供鉴定的水仙基因组总DNA 50ng，10×PCR Buffer 2ul，10mmol/L dNTPs 0.5ul，10mmol/L水仙TCA5上下游引物各1.0ul，5U/L Taq DNA聚合酶 0.2ul，无菌ddH₂O 12.8ul；所述供鉴定的水仙，本发明共提供24份水仙品种样品；

（3）PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃ 延伸45s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；

（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳条件：1×TBE电泳缓冲液，体积比为8%的聚丙烯酰胺凝胶，在电压400V，电流100mA下电泳3.0h后用银染法染色，经ImageScanner Ⅲ凝胶扫描仪扫描保存；

（5）PCR扩增产物的检测鉴定：利用水仙BES-SSR标记引物TCA5，对24份水仙的样品进行品种鉴定，于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的PCR扩增图谱中，在分子量为224bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙金盏银台；在分子量为340bp的位置出现DNA条带，则该品种为中国多花水仙重瓣玉玲珑；在分子量为332bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Replete；在分子量为142bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋小冠水仙Alltruist；在分子量为151bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙Jetfire；在分子量为153bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Tahiti；在分子量为115bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋裂冠水仙Orangerie；在分子量为226bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness；在分子量为144bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋红口水仙Recurvus；在分子量为236bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙Erlicheer；在分子量为369bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋三蕊水仙Thalia；在分子量为123bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Mount Hood；在分子量为195bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋多花水仙White Favourite；在分子量为321bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋长寿花水仙Silver Smiles；在分子量为141bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Pink Charm；在分子量为346bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Johann Strauss；在分子量为319bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋小冠水仙Barret Browning；在分子量为163bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋喇叭水仙Dutch Master；在分子量为117bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Fortissimo；在分子量为164bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Daydream；在分子量为101bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋重瓣水仙Gay Tabor；在分子量为251bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋仙客来水仙Tete-a-Tete；在分子量为213bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Bella Vista；在分子量为143bp的位置出现DNA条带，则该品种为西洋大冠水仙Carlton。