[发明专利]水仙BES-SSR标记引物 TCA5及鉴定水仙品种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种BES-SSR标记引物及其用于作物品种鉴定的方法，具体涉及水仙BES-SSR标记引物TCA5及鉴定水仙品种的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

水仙为石蒜科水仙属 (Narcissus L.) 多年生球根花卉，大多数原产于地中海沿岸及欧洲中部地区，约有40个原生种和许多变种，据英国皇家园艺学会统计，现约有1万多个园艺品种，其花色、花姿十分丰富，且部分水仙具宜人的香味，已成为世界各国广泛栽培的著名观赏兼药用花卉。然而，水仙具有夏季休眠特性，每年开花一次，从花型花色方面鉴定周期较长，耗时耗力，其鳞茎和叶型也十分相似，很难从生物学性状上将其有效地区分开来，对水仙的品种选育及鉴定方面都有着严重的影响。

陈林姣等 (2002年)，朱震霞 (2003年)，Tucci 等 (2004年)，Lu Gang等 (2007)，郑琴芳等 (2012年) 利用第一代分子标记技术RAPD、ISSR、AFLP对中国水仙及水仙的遗传多样性及亲缘关系进行了不同程度的分析；Hodgins等 (2007年) 以欧洲野生黄花水仙为材料，利用富集文库筛选法得到8个微卫星标记，其操作较为复杂且费用较为昂贵；袁菊红 (2011年) 利用得到的10对SSR标记引物对中国石蒜属遗传多样性和亲缘关系进行了分析，其实验材料中涉及中国水仙且扩增出了带型。现有的基于水仙属的分子标记数量了了可见，远远不能满足水仙属分子生物学的研究，这将严重制约了水仙种质资源遗传多样性分析的准确性和遗传图谱构建的精确性。可见，开发新的分子标记鉴定技术，对水仙种质资源遗传多样性进行分析研究，为水仙新品种选育上提供有效的技术支持，在水仙育种及种质鉴定方面有着十分重要的意义。

但是，现有的第一代分子标记如：扩增的限制性内切酶片段长度多态性标记 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)，第一步需要制备高分子量基因组DNA，然后酶切找到特异片段，实验程序繁琐，操作复杂；限制性内切酶片段长度多态性标记 (restriction fragment length polymorphism, RFLP)，技术难度大，操作复杂，所需DNA质量高，要经过Southern杂交且需选用单拷贝探针，标记数量少且多态性较低；随机扩增多态性DNA标记 (randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)和简单序列重复标记 (inter-simple sequence repeat, ISSR)二者均为显性，不能区分是纯合还是杂合个体，且RAPD重复性较低，对DNA模板的质量要求很高，而水仙属植物叶片和鳞茎中含有大量的多糖多酚类物质，这将对DNA提取增加了难度，所以此法不适用于水仙标记分析。

简单重复序列 (simple sequence repeat, SSR) 或称为微卫星DNA (microsatellite DNA)，又称为短串联重复 (short tandem repeats, STR) 是指一类由几个 (多为1-6个) 碱基组成的基序 (motif) 串联而成的DNA序列，为第二代普遍认可的新型分子标记技术，其随机广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，大约每隔10-50kb的DNA序列中就会出现一个SSR位点。SSR标记具有高度的多态性且分布于整个基因组中，用于检测简单易操作，实验重复性高，所需模版DNA量少，仅需微量组织或者干组织样品，便于数据比较分析，SSR遵循孟德尔共显性遗传模式，能够区别纯合显性个体和杂合显性个体等诸多有点。目前SSR标记技术已成为构成遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选和法医鉴定的理想工具，已经广泛应用于拟南芥、大豆、棉花、花生、葡萄、小麦、水稻、番茄、甜菜和油菜等多种植物上。

目前，开发的SSR标记主要有G-SSR (基因组SSR) 和EST-SSR (表达序列标签SSR) 两种，而现有的水仙EST数据库中登录的水仙EST序列还很少，开发SSR标记远远不够，且利用EST序列开发获得的SSR标记多态性较基因组SSR标记低，因此利用水仙基因组中获取SSR位点信息，开发基于水仙基因组的SSR标记引物对水仙种质鉴定和遗传多样性分析等领域提供有效的标记技术，迫在眉睫。

发明内容