[发明专利]板栗过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种板栗过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：

1）根据板栗leafy-like protein mRNA特异性序列设计特异性恒温扩增检测引物；

2）待检样品DNA在上述引物、Bst 2.0 Warmstar DNA 聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在板栗过敏原成分。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：

外引物1：GGAAAGTGGTGGACGTTGAT（SEQ ID No：1）；

外引物2：GGCAATGTTCTGTACCTGGA（SEQ ID No：2）；

内引物1：CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG（SEQ ID No：3）；

内引物2：GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA（SEQ ID No：4）；

环引物1：CACTTCCAACATTACCATTCATGTC（SEQ ID No：5）；

环引物2：GAAGAACGGCCTTGATTACCTC （SEQ ID No：6）。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各2～10μM、内引物1和内引物2各20～60μM、环引物1和环引物2各5～20μM、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶5～10 U、pH8.8的Tris-HCl 20 mM、KCl 8～12 mM、(NH4)₂SO₄ 8～12 mM、0.08～0.12% Tween-20、dNTPs 1.5～1.7mM、MgSO₄ 0.6～1.0mM、甜菜碱0.7～0.9M，待检样品DNA 2μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、环引物1和环引物2各20μM、Bst 2.0 Warmstar DNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl 20 mM、KCl 10 mM、(NH4)₂SO₄ 10 mM、0.1% Tween-20、dNTPs 1.6mM、MgSO₄ 0.8mM、甜菜碱0.8M，待检样品DNA 2μL。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）所述恒温扩增反应的程序为：63～65℃恒温反应45～60min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）可采用曲线法或显色法判断扩增结果，曲线法：在反应体系中恒温加入1-20 μM SYTO-9使用荧光PCR仪或其它恒温荧光检测仪进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性；显色法：在反应体系中加入500-2000×GeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为橙色。

7.一种用于检测板栗过敏原的恒温扩增试剂盒，其包括6条根据板栗leafy-like protein mRNA序列设计的特异性恒温扩增检测引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：

外引物1：GGAAAGTGGTGGACGTTGAT （SEQ ID No：1）；

外引物2：GGCAATGTTCTGTACCTGGA（SEQ ID No：2）；

内引物1：CACGATGAAGGGGTGTTCTCGCTGAGTTGGGTGCAGATCATG（SEQ ID No：3）；

内引物2：GGTGAGGTTGCACGCGGAAACACGGCACTGCTCGTAGA（SEQ ID No：4）；

环引物1：CACTTCCAACATTACCATTCATGTC（SEQ ID No：5）；

环引物2：GAAGAACGGCCTTGATTACCTC （SEQ ID No：6）。