[发明专利]板栗过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术及食品安全检测领域，涉及食品中过敏原成分的检测方法，具体涉及板栗过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法。

背景技术

板栗（Castanea mollissima），又名栗、中国板栗，是壳斗科栗属的植物。板栗是常见的、广泛食用的树生坚果，板栗引起的过敏症状包括面部红肿、眼睛痛、红、痒、荨麻疹、哮喘、嘴唇红肿、恶心反胃、腹痛、低血压、头晕等症状，因而属于食品过敏原标识管理的重要种类。国际食品法典委员会制定的国际标准CODEX STAN 1-1985《预包装食品标签通则》明确规定了树生坚果及其产品必须在预包装食品标签上予以声明。在国际标准的基础上，世界各国纷纷颁布了各自的法规标准，对树生坚果过敏原成分的标识管理进行了详明的规定。欧盟委员会指令2007/68/EC和美国《食品过敏原标识和消费者保护法案》（The Food Allergen Labeling and Consumer Protection Act, FALCPA）均明确规定树生坚果属于必须明确标识的食品过敏原。我国在各级食品标准中也做出了类似的规定，例如《 GB 7718-2011预包装食品标签通则》、《 GB/T 23779-2009预包装食品中的致敏原成分》、《 DB11/Z 521-2008奥运会食品安全 食品过敏原标识标注》、《 DBJ 440100/T 28-2009亚运会食品安全 食品过敏原标识标注》均对此有明确的规定。

食品过敏原标识管理的有效实施，依赖于完善的技术监控手段。其中，食品过敏原检测技术是必不可少的一个组成部分。食品过敏原的检测技术主要分为两类，一类是基于蛋白质的检测方法，一类是基于基因的检测方法。到目前为止，国内外都没有发布过板栗过敏原成分的标准检测方法，也尚未建立任何达到行业应用水平的通用方法。这种现状已经严重影响了板栗过敏原标识管理规定的科学有效实施。

基于蛋白质的检测方法在技术上存在明显的局限性，并不能完全满足食品行业生产管理和监管部门技术监督的需要。基于蛋白质的检测技术局限性表现为：现有研究结果表明食品过敏原中能够引起过敏反应的蛋白质组成复杂，板栗中存在的过敏原蛋白质组成尚未完全调查清楚，因此以过敏原蛋白质为检测目标物质建立的蛋白质检测技术得到的检测结果存在与实际致敏效应发生偏差的可能性；基于免疫学原理的蛋白质检测技术对检测样品提取物的背景干扰具有较高的要求，与此同时由于预包装食品种类、配料成分、加工工艺千差万别造成背景干扰非常复杂，极大局限了板栗过敏原蛋白质免疫检测方法的实际应用效果。此外，相对于核酸而言，板栗过敏原蛋白质容易在食品加工过程中发生变性，对基于免疫学原理的蛋白质检测技术造成不可忽略的性能下降。

相比之下，基于基因检测的方法以食品过敏原的特异性基因片段为检测对象，通过食品中是否存在过敏原所属物种的保守基因片段来判断是否含有某种特定的过敏原成分。由于核酸的稳定程度比蛋白质高，在食品加工过程中不易被破坏，因此这类技术可以更加稳定的检测出微量的过敏原成分。现有常用的基因检测方法为实时荧光PCR法，但是该方法需要使用大型的仪器设备、耗时长、对技术要求高、成本昂贵，并不适用于基层实验室的推广应用。

环介导恒温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称恒温扩增法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要昂贵的特殊设备。与实时荧光PCR方法相比成本更为低廉、操作更为简便，更加适合基层实验室推广应用。

目前尚未有将LAMP法应用于快速检测板栗的试剂盒方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种板栗过敏原的恒温扩增检测方法。

本发明的另一个目的在于提供一种用于检测板栗过敏原的恒温扩增试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一组用于检测板栗过敏原的特异性恒温扩增引物。

本发明所采取的技术方案是：

一种板栗过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：

1）根据板栗leafy-like protein mRNA特异性序列设计特异性恒温扩增检测引物；

2）待检样品DNA在上述引物、Bst 2.0 Warmstar DNA 聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在板栗过敏原成分。

作为优选的，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：