[发明专利]环境微生物快速检测方法

权利要求书

1.一种环境微生物检测方法，其特征在于，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下：

１）微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网，

２）微生物基因组提取，

３）细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，

４）rDNA测序，

５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；

６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。

2.根据权利要求１所述的方法，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。

3.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤１）微生物收集的方法如下：定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22μm滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。

4.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤２）微生物基因组提取的方法如下：样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μL溶菌酶(10 mg/mL), 6μL变溶菌素（25000 U/mL), 3μL溶葡球菌酶(4000 U/mL), 和41μL TE50溶液(10 mM Tris·HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37°C消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100 转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。

5.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤３）中，对于细菌扩增V1到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO 1)，反向引物序列：TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2),

对于真菌扩增V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO３)，反向引物序列：ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO４)。

6.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤４）中，rDNA测序，测序仪优先采用Roche454、Illumina的Miseq，Hiseq二代测序仪。

7.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，步骤５）中，对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncbi.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列，剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群；BLAST序列比对的具体判断标准为（a）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥99％，未知菌株鉴定为该种；（b）与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性≥97％，但<99％，未知菌株鉴定为该属；（c）如未知菌株序列相似性≤97％，未知菌株不能鉴定为该种或属；（d）如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性≥99％，且两者相似性相差≤0.5％，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。

8.根据权利要求１所述的方法，其特征在于，相对于所述步骤１）搜集的微生物的对照样本的收集方法，利用细菌、真菌培养基，收集了该环境各个角落的微生物，包括沉降菌和悬浮菌，将所有的培养基的微生物混合后作为对照样本；同时，平板收集的微生物样本既可以作为对滤网收集的微生物进行有效性评估，还可以增加微生物的检测范围；滤网收集可以在72小时内得到结果，包括可培养和不可培养的微生物，平板收集晚于滤网收集但得到的菌种可以做进一步分析和保藏。