[发明专利]环境微生物快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种环境微生物的检测方法，可提高微生物的检测范围、节省检测费用、大幅度缩短检测时间。

背景技术

  微生物是自然界分布最广泛、数量最大的一类生物。它们个体微小、繁殖速度快、适应能力强。一些微生物经消化道入侵人体，比如说沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌等，它们可造成胃肠道疾病，严重时会造成肝、脑、肾脏器损害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所产生的毒素，比如黄曲霉毒素、伏马菌素等，它们的毒性很强，具有很强的致癌性。另外，微生物及热原若通过粘膜或血管直接侵入人体，将对人体健康造成更严重、更直接的危害。因此，在食品及药品制造过程中，防范微生物污染至关重要。

目前，食品和制药工业普遍采用洁净技术对生产环境中的悬浮微粒、微生物、有毒有害气体进行控制。为同时确保洁净区人员的正常活动，亦须使空气温度、湿度及压力在适宜范围内。洁净厂房及设施的建造不但要采用不易产尘、便于清洁的建筑材料和结构，而且需对空气进行调温、调湿和净化处理，以满足规定净化级别要求。在这种条件下，生产环境中最大的产尘源和微生物污染源通常是操作人员、设备和物料。因此必须使洁净区空气往复循环、动态更新。在洁净区，净化空气一般来自房间顶部的送风口，流经操作区后，携带着人员、设备、设施和物料脱落的微粒（包括微生物）流向低压区域，最后进入回风口，补充新空气后，再次进入空调及过滤系统获得再生。这种有组织的、无紊流的空气流动方式被称为“单向流”。在回风口设置的滤网，可以拦截室内“脏”空气中悬浮的微生物，真实完整地反映洁净区微生物生态特征。洁净技术不但用于生产活动，在食品药品的检验，医疗服务、科学研究领域都有广泛应用。

洁净技术虽然能极大地降低食品药品受到微生物污染的风险，但并不是绝对的无菌环境，也不能杜绝外来微生物侵入被加工物料和产品。实际上，食品和口服药品均允许一定数量的非致病微生物残留。即便是无菌药品，在包装完成后，通常还要接受灭菌处理。只有非最终灭菌的无菌制品，才要求局部环境满足“绝对无菌”的要求。对洁净区或洁净室环境微生物进行监测不但是保证产品质量的要求，也是国家有关强制性法规的要求。洁净区实际上是一个特殊的生态环境，由于人员、设备、物料和大环境相对固定，微生物种群分布相对稳定，但也会随季节、房间消毒措施有规律地变化。了解微生物的种类及数量分布信息，掌握其变化规律，对于针对性地防范微生物污染具有重要意义。如生产环境中是否存在病原微生物；又如在处理淀粉和蛋白质含量较高的物料时，需关注是否存在某些霉菌；又如在生产热消毒产品时，需关注是否存在耐热微生物。此外，当发现产品受到特定微生物污染时，生产环境微生物监测数据将帮助技术人员找到潜在的污染源，进而采取有效的预防措施。另外在微生物检验时，环境而非样品中的微生物会造成检验结果的失真，如果有检验环境背景微生物信息（且具有分子水平的特征信息），就能对检验结果进行甄别。

然而，我国绝大多数的食品、药品生产企业的微生物检验能力还停留在细胞水平。这些检验方法是为适应产品放行检验而建立起来的，在开展微生物污染过程控制的检验方面普遍存在能力不足的情况。同时，传统的微生物学方法只能培养环境中不超过10%的微生物，不仅检测时间长，结果准确率差，而且效率低，工作量大。虽然业界已经开发了一些全自动微生物鉴定仪器，但是它们的鉴定范围受限于已知的微生物数据库。因此传统方法不能真实揭示微生物群落的多样性。总体上看，食品药品工业对于微生物污染处于相对被动的地位，不但缺乏对微生物侵染模式（如微生物种类、数量和途径）进行调查的手段，也缺乏量化的风险评价指标。实际生产中一味采用过度消毒（灭菌）措施，不但盲目低效，而且增加了环境污染和人员安全风险。对超标产品除了报废销毁，别无它途，也难以对后续生产起到指导作用。

发明内容

为监测洁净区微生物的种类和数量分布情况，提供背景环境的微生物信息，本发明提供了一种基于大规模基因测序技术的环境微生物快速检测方法。

     环境微生物检测方法，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下：

１）微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网，

２）微生物基因组提取，

３）细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，

４）rDNA测序，

５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；

６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。