[发明专利]高表达gga-miR-9*的鸡胚成纤维传代细胞株有效

专利信息
申请号: 201310565243.5 申请日: 2013-11-13
公开(公告)号: CN103773735A 公开(公告)日: 2014-05-07
发明(设计)人: 欧阳伟;王永山;潘群兴;王晓丽;夏兴霞;刘华洁;张海彬 申请(专利权)人: 江苏省农业科学院
主分类号: C12N5/10 分类号: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C12R1/93
代理公司: 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 代理人: 张素卿
地址: 210014 江*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 表达 gga mir 鸡胚成 纤维 传代 细胞株
【说明书】:

  

一、技术领域

发明涉及一种能高表达gga-miR-9*的鸡胚成纤维传代细胞株,属于生物技术领域。

二、背景技术

    传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种侵害雏鸡淋巴组织,特别是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的传染病。该病不但引起患病动物死亡,而且还导致机体免疫抑制,使机体的免疫防御能力降低和疫苗免疫接种失败。由于IBDV的生物学性质稳定、易变异以及多种禽鸟类可携带传播,致该病毒难以根除,目前,仍是危害养鸡业的主要传染病之一。

IBDV属双RNA病毒科,基因组包括大(A)小(B)两个节段,编码五种病毒蛋白:VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP1是病毒的非结构蛋白,是由B节段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp),VP1与病毒RNA的复制和毒力有关。A节段含有两个部分重叠的开放阅读框(ORF),其中一个大ORF编码多聚蛋白,然后被加工成VP2、VP4和VP3。VP2和VP3是病毒的结构蛋白,构成病毒衣壳,VP2占结构蛋白总量的51%,既是病毒的主要结构蛋白,又是病毒的主要保护性抗原。VP3和病毒RNA组成螺旋状的核蛋白复合物,位于病毒颗粒内部。VP4为病毒自身蛋白酶。另一个小ORF编码VP5,是病毒的非结构蛋白,与病毒的毒力和复制效率有关。 

接种疫苗是预防IBD的有效方法,可降低发病率,减少经济损失。目前,IBD灭活疫苗或弱毒活苗的生产主要采用鸡胚或原代鸡胚成纤维细胞培养IBDV的方法,该方法的生产成本高,批间差异较大,更大的问题是在疫苗生产过程中存在着蛋源性和外源性疫病传播的巨大风险。用鸡胚成纤维传代细胞系DF-1培养IBDV,病毒滴度较低,生产成本高。因此,亟需构建培育一种能够安全高效培养IBDV的细胞株。 

microRNA (miRNA)是由19-25个核苷酸(3′端可有1~2个碱基长度的变化)组成的内源非编码小RNA,是一类基因表达调控因子,在转录后和翻译水平调控着基因的表达。miRNA本身不具有开放阅读框(ORF),但可以作为一种引导性分子通过碱基配对与靶mRNA结合,从而在转录后水平引起靶mRNA的剪切或是翻译的抑制,在不同的调节途径中发挥关键作用,包括发育时序的控制、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、代谢、激素分泌、肿瘤发生、免疫应答等多种生理和病理过程 。 

为了分析细胞miRNA对IBDV复制的影响,我们用IBDV 强毒感染SPF鸡,用miRNA芯片技术分析IBDV感染之后的细胞内源性miRNA表达量的变化,结果显示IBDV感染对细胞内源性miRNA的表达影响显著,表达上调的microRNA有30个,表达下调的microRNA有18个。对这些miRNA进行过表达和抑制表达试验分析,发现gga-miR-9*可显著促进IBDV在DF-1细胞中的复制。 

本发明的目的是基于细胞内源性gga-miR-9*可促进IBDV复制的分子调控功能,运用慢病毒表达系统构建一株能高表达细胞内源性gga-miR-9*的鸡胚成纤维传代细胞株,该细胞株培养IBDV,能够显著提高细胞培养物中IBDV的滴度,可高效地用于IBDV抗原制备和疫苗生产。 

  

三、发明内容

技术问题  

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、热性、高度接触性传染病,是引起我国及世界养禽业经济损失严重的主要传染病之一。

接种疫苗是预防IBD的有效方法,可降低发病率,减少经济损失。目前,IBD灭活疫苗或弱毒活苗的生产主要采用鸡胚或原代鸡胚成纤维细胞培养IBDV的方法,该方法的生产成本高,批间差异较大,更大的问题是在疫苗生产过程中存在着蛋源性和外源性疫病传播的巨大风险。用鸡胚成纤维传代细胞系DF-1培养IBDV,病毒滴度较低,生产成本高。因此,亟需构建培育一种能够安全高效培养IBDV的细胞株。 

    本发明的目的是基于细胞内源性gga-miR-9*可促进IBDV复制的分子调控功能,运用慢病毒表达系统构建一株能高表达细胞内源性gga-miR-9*的鸡胚成纤维传代细胞株,用细胞株培养IBDV,能够显著提高细胞培养物中IBDV的滴度,可高效地用于IBDV抗原制备和疫苗生产。 

  

技术方案

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